※ 引述《joycenino (joycenino)》之銘言： : 大家好: : 想請教大家關於Southern DIG的實驗問題... : 因為本實驗室尚無系統，我做了好幾次都只有marker跟positive control有雜合訊號.. : 我的材料是比較少人做的中草藥植物.." : 用CTAB法抽取DNA : 以下有幾個問題想請教大家..> < : 1.植物gDNA的濃度 (這應該是最主要的問題..?) : 我之前都是用O.D值測DNA的濃度，同時也會跑膠check : 雖然我知道O.D.值沒那麼準...但還是用它估算約15 ug 的DNA : 去切酵素 : 想問大家大概都拿多少的DNA去做southern dig 15ug!! 要想想酵素切不切的動，以前都拿2~3ug，甚至1ug就夠了 : 2.探針 : 想問大家做探針的方法，畢竟植物genome複雜，都會擔心探針效率好不好 : a. 說明書是寫把insert接到T-vector裡面，再用酵素切，跑膠回收片段 : 拿去做探針。但切膠回收感覺都會流失很多...這方法我還沒試過 : b. PCR產物直接以Kit純化，之前都是用這方法做探針 : 探針效率以說明書的方法測試，也是ok的 : c. PCR產物跑膠之後，切膠回收片段，這方法我也沒試過.. : 這三種哪種方法比較好...? 以前都是用PCR clean kit 直接回收片段當probe 要先跑膠確認size是否正確，通常 dig label 的片段會大一些，所以會準備 一個不加 dig 當 control(這個PCR product 可以留下來當以後製備probe的材料) : 3.目前實驗室有兩組Kit : DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I : (Kit for color detection with NBT/BCIP) : DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II : (Kit for chemiluminescent detection with CSPD, ready-to use) : 我知道是呈色方法不同，據廠商說是CSPD比較靈敏.. : 但我用CSPD也沒有成功過.. : 想問這兩組kit哪一組比較好，或是有做成功的人可分享一下經驗嗎? : 我已經失敗到心灰意冷了> < : 謝謝大家幫忙 及 耐心看完我的問題 你有提到positive control有signal，可是你的樣品都沒有，可能是 1) 樣品沒有你要的 insert，都用到15ug了，不至於看不到 2) Probe label dig 有成功，但不是你要的probe 這是我能想到的，還有大大可以補充嗎? --

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