※ 引述《joycenino (joycenino)》之铭言： : 大家好: : 想请教大家关於Southern DIG的实验问题... : 因为本实验室尚无系统，我做了好几次都只有marker跟positive control有杂合讯号.. : 我的材料是比较少人做的中草药植物.." : 用CTAB法抽取DNA : 以下有几个问题想请教大家..> < : 1.植物gDNA的浓度 (这应该是最主要的问题..?) : 我之前都是用O.D值测DNA的浓度，同时也会跑胶check : 虽然我知道O.D.值没那麽准...但还是用它估算约15 ug 的DNA : 去切酵素 : 想问大家大概都拿多少的DNA去做southern dig 15ug!! 要想想酵素切不切的动，以前都拿2~3ug，甚至1ug就够了 : 2.探针 : 想问大家做探针的方法，毕竟植物genome复杂，都会担心探针效率好不好 : a. 说明书是写把insert接到T-vector里面，再用酵素切，跑胶回收片段 : 拿去做探针。但切胶回收感觉都会流失很多...这方法我还没试过 : b. PCR产物直接以Kit纯化，之前都是用这方法做探针 : 探针效率以说明书的方法测试，也是ok的 : c. PCR产物跑胶之後，切胶回收片段，这方法我也没试过.. : 这三种哪种方法比较好...? 以前都是用PCR clean kit 直接回收片段当probe 要先跑胶确认size是否正确，通常 dig label 的片段会大一些，所以会准备 一个不加 dig 当 control(这个PCR product 可以留下来当以後制备probe的材料) : 3.目前实验室有两组Kit : DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I : (Kit for color detection with NBT/BCIP) : DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II : (Kit for chemiluminescent detection with CSPD, ready-to use) : 我知道是呈色方法不同，据厂商说是CSPD比较灵敏.. : 但我用CSPD也没有成功过.. : 想问这两组kit哪一组比较好，或是有做成功的人可分享一下经验吗? : 我已经失败到心灰意冷了> < : 谢谢大家帮忙 及 耐心看完我的问题 你有提到positive control有signal，可是你的样品都没有，可能是 1) 样品没有你要的 insert，都用到15ug了，不至於看不到 2) Probe label dig 有成功，但不是你要的probe 这是我能想到的，还有大大可以补充吗? --

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