作者bread75312 (阿徐)
看板Biotech
標題[求救] HepG2 生長問題
時間Wed Feb 27 18:21:37 2013
培養方法-----
解凍:凍管自液態氮取出後迅速於37度解凍,拿出來後2分鐘內解凍完畢
然後用pipete吸取放入flask中
培養:解凍後24小時換液將DMSO移除,之後接著養到flask內細胞九分滿
繼代:將舊medium移除,用PBS洗去殘餘medium,接著用trypsin-EDTA於37度作用1.5-2分鐘
(trypsin買的時候是10X,使用時以1mlPBS對0.1ml稀釋)
接著以一分二的密度分盤
每兩天會換一次MEDIUM
問題1>作用兩分鐘是否太久??板上有大大作用1分鐘即可??
問題2>medium目前使用DMEM,paper也有人用MEM或RPMI,請問有人養過覺得哪個好呢??
目前最大問題3>在解凍後至第二代都還可以,可是再到第三代後生長變得很慢甚至沒長
但他也沒有浮起來或死亡,但好像會漸漸死亡
請問是我的方法有問題嗎??
因為前一陣子養都還好
目前唯一的不同就是血清換了新的批號,trypsin 也換了一種
這兩個會影響嗎??
實在是已經不知道怎麼辦了.....
請各位大人幫小的解答 (跪
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◆ From: 140.127.19.160
※ 編輯: bread75312 來自: 140.127.19.160 (02/27 18:24)
1F：推 shiningspark:1.沒算時間，看到全融沒浮冰就會馬上拿出來 02/28 06:02
2F：→ shiningspark:實驗看起來沒太大問題，跟鄰居交換血清試試看 02/28 06:04
3F：→ tchan:DMSO在24小時後才移除？凍細胞時至少5%以上，我都2小時就換 02/28 11:07
4F：→ tchan:或者說細胞貼盤以後就換，總之不會超過5小時才換就是了 02/28 11:09
5F：推 im9527tw:我養HepG2步驟都跟你差不多,只是用的medium是RPMI,繼代時 02/28 14:31
6F：→ im9527tw:甚至都是1x trypsin切10分鐘,沒有發生過不生長的情形 02/28 14:32
7F：→ im9527tw:DMSO在24小時後才移除沒有問題喔,食工所也是這樣建議 02/28 14:33
8F：→ im9527tw:還有生長緩慢或不生長也要考慮是否有Mycoplasma汙染 02/28 14:35
9F：→ bread75312:感謝各位大人!! 小的還有思考是不是繼代數已達上限?? 02/28 15:28
10F：→ bread75312:因實驗室細胞株也都是從別的實驗是拿來養的 02/28 15:32
11F：推 leptoneta:HepG2應該比較不會有繼代數的問題 02/28 19:33
12F：→ tchan:重新看了一下，我覺得你先去確認到底medium是否用對，未經馴 03/01 00:27
13F：→ tchan:化而使用錯誤的medium真的在養個兩三代以後就會開始很不健康 03/01 00:27
14F：推 mandible:我覺得是血清~跟隔壁家借一下血清吧! 03/01 10:01
15F：→ chvkimo:我在水浴解凍的時候 只要內容物會移動 就開始拿去操作台 03/02 09:42
16F：→ chvkimo:操作後續步驟 不會等到全部融解 給你參考看看 03/02 09:42
17F：推 kkelvin:我養HepG2 trypsin都切超久的耶 XD 03/04 11:03
18F：→ bread75312:感謝各位解答!!會去試試看其他方法的!! 03/04 15:21