作者bread75312 (阿徐)
看板Biotech
标题[求救] HepG2 生长问题
时间Wed Feb 27 18:21:37 2013
培养方法-----
解冻:冻管自液态氮取出後迅速於37度解冻,拿出来後2分钟内解冻完毕
然後用pipete吸取放入flask中
培养:解冻後24小时换液将DMSO移除,之後接着养到flask内细胞九分满
继代:将旧medium移除,用PBS洗去残余medium,接着用trypsin-EDTA於37度作用1.5-2分钟
(trypsin买的时候是10X,使用时以1mlPBS对0.1ml稀释)
接着以一分二的密度分盘
每两天会换一次MEDIUM
问题1>作用两分钟是否太久??板上有大大作用1分钟即可??
问题2>medium目前使用DMEM,paper也有人用MEM或RPMI,请问有人养过觉得哪个好呢??
目前最大问题3>在解冻後至第二代都还可以,可是再到第三代後生长变得很慢甚至没长
但他也没有浮起来或死亡,但好像会渐渐死亡
请问是我的方法有问题吗??
因为前一阵子养都还好
目前唯一的不同就是血清换了新的批号,trypsin 也换了一种
这两个会影响吗??
实在是已经不知道怎麽办了.....
请各位大人帮小的解答 (跪
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.127.19.160
※ 编辑: bread75312 来自: 140.127.19.160 (02/27 18:24)
1F：推 shiningspark:1.没算时间，看到全融没浮冰就会马上拿出来 02/28 06:02
2F：→ shiningspark:实验看起来没太大问题，跟邻居交换血清试试看 02/28 06:04
3F：→ tchan:DMSO在24小时後才移除？冻细胞时至少5%以上，我都2小时就换 02/28 11:07
4F：→ tchan:或者说细胞贴盘以後就换，总之不会超过5小时才换就是了 02/28 11:09
5F：推 im9527tw:我养HepG2步骤都跟你差不多,只是用的medium是RPMI,继代时 02/28 14:31
6F：→ im9527tw:甚至都是1x trypsin切10分钟,没有发生过不生长的情形 02/28 14:32
7F：→ im9527tw:DMSO在24小时後才移除没有问题喔,食工所也是这样建议 02/28 14:33
8F：→ im9527tw:还有生长缓慢或不生长也要考虑是否有Mycoplasma污染 02/28 14:35
9F：→ bread75312:感谢各位大人!! 小的还有思考是不是继代数已达上限?? 02/28 15:28
10F：→ bread75312:因实验室细胞株也都是从别的实验是拿来养的 02/28 15:32
11F：推 leptoneta:HepG2应该比较不会有继代数的问题 02/28 19:33
12F：→ tchan:重新看了一下，我觉得你先去确认到底medium是否用对，未经驯 03/01 00:27
13F：→ tchan:化而使用错误的medium真的在养个两三代以後就会开始很不健康 03/01 00:27
14F：推 mandible:我觉得是血清~跟隔壁家借一下血清吧! 03/01 10:01
15F：→ chvkimo:我在水浴解冻的时候 只要内容物会移动 就开始拿去操作台 03/02 09:42
16F：→ chvkimo:操作後续步骤 不会等到全部融解 给你参考看看 03/02 09:42
17F：推 kkelvin:我养HepG2 trypsin都切超久的耶 XD 03/04 11:03
18F：→ bread75312:感谢各位解答!!会去试试看其他方法的!! 03/04 15:21