※ 引述《jjcs1001 (以平凡創造奇蹟！)》之銘言： : 嘗試了很多次 : 但全長始終P不出來(3045 bps) : 奇妙的是，之前再做其他實驗有P出這個gene的3'端fragment(768 bps) : 但現在老師要求保險起見，想要看全長蛋白的表現 : 但是我始終P不出來，有可能是template cDNA已經斷光了嗎? : 還是我的primer設計有問題呢? : 我全長兩端primer設計如下： : F-AAAGGATCCA"ATGAAGGTACCTGTATCCGGG" : R-AAAGCGGCCGC"ATTCACAAACTCAATGTAATTTGCTG" : " "內是與gene互黏的序列，" "以外則是切位跟多留的bps : 我的PCR條件是 : 94度 30' : 55度 30' : 72度 3"10' : 老師說可以嘗試分段PCR再接起來，可是我查過，上面的切位真的很稀少，而且很冷門 : 我到底該怎麼辦? 我不知道你使用的是哪一種 polymerase， 但是有些 polymerase 對於長片段的 DNA 效果很差。 如果你的 cDNA 是完好沒有問題的， 而且 primer 是正確的且不考慮 polymerase 的問題， 那還有一種可能， 就是你要 PCR 的序列屬於 GC-rich， 這種情況也很容易造成 PCR 幾乎沒有產物， 解決方法是 PCR 時加入 GC-rich 的 buffer， 這個 Buffer 應該很多公司都有在賣。 我之前的經驗， 相同的 PCR 條件下， 如果沒加 GC-rich buffer， 一個 2300 bps 的序列有產物， 可是 2800 bps 的序列就做不出來了， 那時還把 extension 的時間設定到 4 Min， 依然沒辦法做出 2800 bps 的那個序列， 後來加入 GC-rich buffer 後問題就解決了。 所以現在只要我的 PCR 的產物超過 2500 bp， 無論序列是不是 GC-rich， 我都會加入那個 Buffer。 --

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