作者xxtomnyxx (翼天)
看板Biotech
标题Re: [求救] 如何 PCR full-length cDNA?
时间Fri Feb 22 17:28:25 2013
※ 引述《jjcs1001 (以平凡创造奇蹟！)》之铭言：
: 尝试了很多次
: 但全长始终P不出来(3045 bps)
: 奇妙的是，之前再做其他实验有P出这个gene的3'端fragment(768 bps)
: 但现在老师要求保险起见，想要看全长蛋白的表现
: 但是我始终P不出来，有可能是template cDNA已经断光了吗?
: 还是我的primer设计有问题呢?
: 我全长两端primer设计如下：
: F-AAAGGATCCA"ATGAAGGTACCTGTATCCGGG"
: R-AAAGCGGCCGC"ATTCACAAACTCAATGTAATTTGCTG"
: " "内是与gene互黏的序列，" "以外则是切位跟多留的bps
: 我的PCR条件是
: 94度 30'
: 55度 30'
: 72度 3"10'
: 老师说可以尝试分段PCR再接起来，可是我查过，上面的切位真的很稀少，而且很冷门
: 我到底该怎麽办?
我不知道你使用的是哪一种 polymerase，
但是有些 polymerase 对於长片段的 DNA 效果很差。
如果你的 cDNA 是完好没有问题的，
而且 primer 是正确的且不考虑 polymerase 的问题，
那还有一种可能，
就是你要 PCR 的序列属於 GC-rich，
这种情况也很容易造成 PCR 几乎没有产物，
解决方法是 PCR 时加入 GC-rich 的 buffer，
这个 Buffer 应该很多公司都有在卖。
我之前的经验，
相同的 PCR 条件下，
如果没加 GC-rich buffer，
一个 2300 bps 的序列有产物，
可是 2800 bps 的序列就做不出来了，
那时还把 extension 的时间设定到 4 Min，
依然没办法做出 2800 bps 的那个序列，
後来加入 GC-rich buffer 後问题就解决了。
所以现在只要我的 PCR 的产物超过 2500 bp，
无论序列是不是 GC-rich，
我都会加入那个 Buffer。
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