作者cmublue (BLUE)
看板Biotech
標題[求救] IHC染核內protein的方法
時間Thu Feb 21 21:25:07 2013
小弟最近在做IHC，組織是臨床子宮內膜癌檢體，
要看得是estrogen receptor beta，它是一種表現在核內的protein
但是幾次的實驗下來雖然都有染到東西，但是卻都表現在cytosol內
是有想過增加triton的時間，但是又不知道該怎麼抓，
也聽說triton太久會不好，
想請教各位先進有何解決辦法?
以下是小弟的實驗條件!
-------------
2.EtOH (因為可與xylene互溶)，100% 5分鐘 X 2 times；依序以90%，70%，50%的EtOH
浸潤各三分鐘，此作用為覆水。
3.以ddH2O浸潤10 sec左右即可 (讓組織慢慢曝露出來)
4.以citric acid (PH6.0)浸泡並以高壓滅菌鍋滅菌10min
*citric acid buffer為10mM (Stcok為200mM)
5.降溫後以PBS wash 10 min/each x2
6.將玻片擦乾，再sample周圍畫圈，並以0.5% Triton in PBS作用(打洞) 10min
7.以PBS wash 10 min/each x2
8.3% H2O2 (in H2O),10 min
9. 以PBS wash 10 min/each x2
10.一抗為(1:150) 作用O/N，約100ul/片
11. 1X PBS wash 8 min x 2次
12. 二抗 30min
13. 1X PBS wash 8 min x 2次
14. HRP (Streptaridin Peroxidase), 20min
15. 1X PBS wash 8 min x 2次
16. 呈色 (Stable AEC solution)
*以microscope觀察，需看多久會呈色，呈色後即放入PBS 中止反應
(時間約為12min)
17.染核 1min (染劑為Mayers Hamalann losung Hx948000, C17290)
18.紅色部分才是要的 (COX-2)
19.wash,用水直接沖，但不能直接沖組織。
20.擦乾and晾乾。
21.封片，將封片膠DPX mountant for histology (cat. 44581 sigma)滴在組織外側
，蓋上蓋玻片使封片膠均勻覆蓋住整個組織。
----------
感謝各位回覆~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 180.176.8.224
1F：推 goshr:我認為你應該改用EDTA pH8 02/21 22:23
2F：推 abcam:可試試其它的抗原修復液呀! 02/21 22:32
3F：推 kirby0415:我染核沒在用triton耶 試試citric acid pH8或10 或boric 02/22 00:30
4F：→ kirby0415:acid+EDTA pH8 02/22 00:31