作者cmublue (BLUE)
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标题[求救] IHC染核内protein的方法
时间Thu Feb 21 21:25:07 2013
小弟最近在做IHC，组织是临床子宫内膜癌检体，
要看得是estrogen receptor beta，它是一种表现在核内的protein
但是几次的实验下来虽然都有染到东西，但是却都表现在cytosol内
是有想过增加triton的时间，但是又不知道该怎麽抓，
也听说triton太久会不好，
想请教各位先进有何解决办法?
以下是小弟的实验条件!
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2.EtOH (因为可与xylene互溶)，100% 5分钟 X 2 times；依序以90%，70%，50%的EtOH
浸润各三分钟，此作用为覆水。
3.以ddH2O浸润10 sec左右即可 (让组织慢慢曝露出来)
4.以citric acid (PH6.0)浸泡并以高压灭菌锅灭菌10min
*citric acid buffer为10mM (Stcok为200mM)
5.降温後以PBS wash 10 min/each x2
6.将玻片擦乾，再sample周围画圈，并以0.5% Triton in PBS作用(打洞) 10min
7.以PBS wash 10 min/each x2
8.3% H2O2 (in H2O),10 min
9. 以PBS wash 10 min/each x2
10.一抗为(1:150) 作用O/N，约100ul/片
11. 1X PBS wash 8 min x 2次
12. 二抗 30min
13. 1X PBS wash 8 min x 2次
14. HRP (Streptaridin Peroxidase), 20min
15. 1X PBS wash 8 min x 2次
16. 呈色 (Stable AEC solution)
*以microscope观察，需看多久会呈色，呈色後即放入PBS 中止反应
(时间约为12min)
17.染核 1min (染剂为Mayers Hamalann losung Hx948000, C17290)
18.红色部分才是要的 (COX-2)
19.wash,用水直接冲，但不能直接冲组织。
20.擦乾and晾乾。
21.封片，将封片胶DPX mountant for histology (cat. 44581 sigma)滴在组织外侧
，盖上盖玻片使封片胶均匀覆盖住整个组织。
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感谢各位回覆~
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◆ From: 180.176.8.224
1F：推 goshr:我认为你应该改用EDTA pH8 02/21 22:23
2F：推 abcam:可试试其它的抗原修复液呀! 02/21 22:32
3F：推 kirby0415:我染核没在用triton耶 试试citric acid pH8或10 或boric 02/22 00:30
4F：→ kirby0415:acid+EDTA pH8 02/22 00:31