作者jjcs1001 (以平凡創造奇蹟！)
看板Biotech
標題[求救] 如何 PCR full-length cDNA?
時間Thu Feb 21 17:08:37 2013
嘗試了很多次
但全長始終P不出來(3045 bps)
奇妙的是，之前再做其他實驗有P出這個gene的3'端fragment(768 bps)
但現在老師要求保險起見，想要看全長蛋白的表現
但是我始終P不出來，有可能是template cDNA已經斷光了嗎?
還是我的primer設計有問題呢?
我全長兩端primer設計如下：
F-AAAGGATCCA"ATGAAGGTACCTGTATCCGGG"
R-AAAGCGGCCGC"ATTCACAAACTCAATGTAATTTGCTG"
" "內是與gene互黏的序列，" "以外則是切位跟多留的bps
我的PCR條件是
94度 30'
55度 30'
72度 3"10'
老師說可以嘗試分段PCR再接起來，可是我查過，上面的切位真的很稀少，而且很冷門
我到底該怎麼辦?
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不要可憐自己，那是下等人做的事！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.86
1F：→ blence:兩條" "的序列拿去blast無法共同對應到同一gene,甚至疑似的 02/21 18:17
2F：→ blence:gene也不是3kpbs,是NCBI database不夠完整嗎？ 02/21 18:18
3F：→ shenhsu:如果沒切位要接也是可以blunt end接...但機率..XD 02/21 18:26
4F：→ shenhsu:或者找找看有沒有TCTAGT這種 非單一enzyme的切位 02/21 18:28
5F：→ shenhsu:TCTAGT可以一邊用XbaI一邊用SpeI接 我記還有其他這種序列 02/21 18:29
6F：→ shenhsu:當然template也是問題..P長片段時抽RNA和轉cDNA品質都要好 02/21 18:31
7F：→ darkdoor:有試過其他溫度PCR嗎?annealing temp 有點太高了... 02/21 19:18
8F：推 alaric:用overlap PCR, 分段p出, 再PCR接起. 02/21 20:14
9F：→ jjcs1001:請問樓上的前輩，是先分段overlap分段P出來之後，再把 02/22 12:07
10F：→ jjcs1001:P出來的產物都加到同一管當成是template嗎? 02/22 12:08
11F：→ shenhsu:加在一起後我們會先煮沸sample再讓它緩慢恢復室溫 再做PCR 02/22 16:07
12F：推 jabari:RACE kit 02/22 17:15