作者jjcs1001 (以平凡创造奇蹟！)
看板Biotech
标题[求救] 如何 PCR full-length cDNA?
时间Thu Feb 21 17:08:37 2013
尝试了很多次
但全长始终P不出来(3045 bps)
奇妙的是，之前再做其他实验有P出这个gene的3'端fragment(768 bps)
但现在老师要求保险起见，想要看全长蛋白的表现
但是我始终P不出来，有可能是template cDNA已经断光了吗?
还是我的primer设计有问题呢?
我全长两端primer设计如下：
F-AAAGGATCCA"ATGAAGGTACCTGTATCCGGG"
R-AAAGCGGCCGC"ATTCACAAACTCAATGTAATTTGCTG"
" "内是与gene互黏的序列，" "以外则是切位跟多留的bps
我的PCR条件是
94度 30'
55度 30'
72度 3"10'
老师说可以尝试分段PCR再接起来，可是我查过，上面的切位真的很稀少，而且很冷门
我到底该怎麽办?
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不要可怜自己，那是下等人做的事！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.86
1F：→ blence:两条" "的序列拿去blast无法共同对应到同一gene,甚至疑似的 02/21 18:17
2F：→ blence:gene也不是3kpbs,是NCBI database不够完整吗？ 02/21 18:18
3F：→ shenhsu:如果没切位要接也是可以blunt end接...但机率..XD 02/21 18:26
4F：→ shenhsu:或者找找看有没有TCTAGT这种 非单一enzyme的切位 02/21 18:28
5F：→ shenhsu:TCTAGT可以一边用XbaI一边用SpeI接 我记还有其他这种序列 02/21 18:29
6F：→ shenhsu:当然template也是问题..P长片段时抽RNA和转cDNA品质都要好 02/21 18:31
7F：→ darkdoor:有试过其他温度PCR吗?annealing temp 有点太高了... 02/21 19:18
8F：推 alaric:用overlap PCR, 分段p出, 再PCR接起. 02/21 20:14
9F：→ jjcs1001:请问楼上的前辈，是先分段overlap分段P出来之後，再把 02/22 12:07
10F：→ jjcs1001:P出来的产物都加到同一管当成是template吗? 02/22 12:08
11F：→ shenhsu:加在一起後我们会先煮沸sample再让它缓慢恢复室温 再做PCR 02/22 16:07
12F：推 jabari:RACE kit 02/22 17:15