現在回有點久了，不過因為我最近跑了快 20 次的 454。 (抽 gDNA，library 製備，[emulsion PCR，enrichment，上機] 其中 [] 部分不斷 cycle....) 我想以我對 454 的了解，我可以來解釋一下～～ ※ 引述《lalakuku (黑鮪魚)》之銘言： : 小弟上網查了些資料還是有些部分不太懂 : 以下問題: : 1.待擴增的序列會在它的兩端各接上A B adaptor : 那這兩個adaptor是如何判別要接在序列的哪一側? : ex:A adaptor 接5' B adaptor 接3' 舊的 kit 或是你看 Nature 的原始 paper 會寫說有 A B 兩個 adaptors。 問題來了，怎麼確定你的 library 剛好兩端接 1A 1B? 這問題我剛做的時候也是納悶很久，後來我跑去看原始論文才豁然開朗。 有興趣知道的話，這部份請看原始 paper 的補充資料： 檔案名稱 nature03959-s3.doc，來自下面這篇 Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS et al. (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437, 376-80. 裡面有提到: The A and B adaptors differed in both nucleotide sequence and the presence of a 5’ biotin tag on the B adaptor. The adaptor pairs were designed to allow directional ligation to the blunt-ended, fragmented genomic DNA (Adaptor A: CCATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAG. Adaptor B: /5BioTEG/CCTATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATCCCCTGTTGCGTGTCTCAG). 也就是說 B adaptor 有多接一個 biotin 在上面，原始 protocol 有一個 streptavidin 微珠純化的步驟，將有 AB 跟 BB 組合情形的 ligates 抓住。 之後 emulsion PCR primers 是針對 A 跟 B 設計的 pairs，BB 不會被放大， 所以最後 enrichment 也抓不來，最後只會有 AB 組合的 DNA insert 會被送去定序。 (Enrichment 是指經過 emulsion PCR 之後，一條 DNA 大約會變成 100 萬條， 然後利用磁珠與 enrichment primer 去抓那些有大量 DNA 的微珠，只有一條 DNA 的 微珠因為分子作用力太小，不會被吸付，只有被 PCR 成功放大的才會被 enrichment。) 不曉得這樣講你清不清楚，不過現在不這樣做了，現在使用一種叫 Y-shape 的 adaptor ，這個 adaptor 其實就是 A+B 但是 Y 的基部部分序列相同，所以黏在一起，ligation 的時候兩邊都黏上了一樣的 Y adaptors，但是其實兩股 DNA 會像下面這樣： 5'-A-DNA(+)-B-3' 3'-B-DNA(-)-A-5' 怎麼樣接都是剛好有 A 跟 B，只能說有些人實在太聰明了，這個 kit 現在叫做 Rapid library kit，詳細有興趣可以看下面這篇文章： Zheng Z, Advani A, Melefors Ö, Glavas S, Nordström H, Ye W, Engstrand L, Andersson AF (2011) Titration-free 454 sequencing using Y adapters. Nat Protoc 6, 1367-76. : 2.當被選定的序列與微珠結合，那微珠是利用何種方式 : 來篩選只與這條序列作結合？（資料上寫說一顆微珠只與一條特定序列接合） : 那會不會有一顆微珠上接著很多序列的情形發生？要如何排除？ 這個問題叫做 emulsion titration，先用小反應去抓出最後多少數目的微珠會被 enrichment，最好的 % 落在 10-20% 之間 (% 意思是 enrichment 之後的微珠除以 最初放入的微珠數)，也就是想要一條 DNA 配一顆微珠，有一條 DNA 你要放 10 到 20 顆微珠，以此類推。 但基本上微珠數量是 kit 裡頭固定的，你要做的就是算要放入多少數目的 DNA。 這部份需要製作 library 時就用 qPCR 把這個數量算準來。 經過 emulsion titration 之後，你會得到一個 "DNA 數目/微珠數目" 對應到最後 enrichment % 的比率，這個比值最好是會產生出 10-20% enrichment rate 為最佳。 所以簡單來說，一條 DNA 接上一個微珠，這樣的情形，是利用大量的微珠去稀釋掉 DNA 跟微珠的作用力而來的，10-20% 是 Roche 的實驗經驗法則，也就是說，90% 的 微珠都會被丟掉，沒有任何 DNA 在上面，但是剩下 10% 左右的微珠，上面會剛好有 一條 DNA，當然這是理想狀態，實際上還是會有一些微珠上面有好幾條的，但是比例 較少。 : 以上這兩個點我搞不太清楚詳情 : 請專業的鄉民們替我解答　謝謝>"< 以上～～ 希望能讓大家多了解一點 454 的實際操作原理。 --

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