现在回有点久了，不过因为我最近跑了快 20 次的 454。 (抽 gDNA，library 制备，[emulsion PCR，enrichment，上机] 其中 [] 部分不断 cycle....) 我想以我对 454 的了解，我可以来解释一下～～ ※ 引述《lalakuku (黑鲔鱼)》之铭言： : 小弟上网查了些资料还是有些部分不太懂 : 以下问题: : 1.待扩增的序列会在它的两端各接上A B adaptor : 那这两个adaptor是如何判别要接在序列的哪一侧? : ex:A adaptor 接5' B adaptor 接3' 旧的 kit 或是你看 Nature 的原始 paper 会写说有 A B 两个 adaptors。 问题来了，怎麽确定你的 library 刚好两端接 1A 1B? 这问题我刚做的时候也是纳闷很久，後来我跑去看原始论文才豁然开朗。 有兴趣知道的话，这部份请看原始 paper 的补充资料： 档案名称 nature03959-s3.doc，来自下面这篇 Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS et al. (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437, 376-80. 里面有提到: The A and B adaptors differed in both nucleotide sequence and the presence of a 5’ biotin tag on the B adaptor. The adaptor pairs were designed to allow directional ligation to the blunt-ended, fragmented genomic DNA (Adaptor A: CCATCTCATCCCTGCGTGTCCCATCTGTTCCCTCCCTGTCTCAG. Adaptor B: /5BioTEG/CCTATCCCCTGTGTGCCTTGCCTATCCCCTGTTGCGTGTCTCAG). 也就是说 B adaptor 有多接一个 biotin 在上面，原始 protocol 有一个 streptavidin 微珠纯化的步骤，将有 AB 跟 BB 组合情形的 ligates 抓住。 之後 emulsion PCR primers 是针对 A 跟 B 设计的 pairs，BB 不会被放大， 所以最後 enrichment 也抓不来，最後只会有 AB 组合的 DNA insert 会被送去定序。 (Enrichment 是指经过 emulsion PCR 之後，一条 DNA 大约会变成 100 万条， 然後利用磁珠与 enrichment primer 去抓那些有大量 DNA 的微珠，只有一条 DNA 的 微珠因为分子作用力太小，不会被吸付，只有被 PCR 成功放大的才会被 enrichment。) 不晓得这样讲你清不清楚，不过现在不这样做了，现在使用一种叫 Y-shape 的 adaptor ，这个 adaptor 其实就是 A+B 但是 Y 的基部部分序列相同，所以黏在一起，ligation 的时候两边都黏上了一样的 Y adaptors，但是其实两股 DNA 会像下面这样： 5'-A-DNA(+)-B-3' 3'-B-DNA(-)-A-5' 怎麽样接都是刚好有 A 跟 B，只能说有些人实在太聪明了，这个 kit 现在叫做 Rapid library kit，详细有兴趣可以看下面这篇文章： Zheng Z, Advani A, Melefors Ö, Glavas S, Nordström H, Ye W, Engstrand L, Andersson AF (2011) Titration-free 454 sequencing using Y adapters. Nat Protoc 6, 1367-76. : 2.当被选定的序列与微珠结合，那微珠是利用何种方式 : 来筛选只与这条序列作结合？（资料上写说一颗微珠只与一条特定序列接合） : 那会不会有一颗微珠上接着很多序列的情形发生？要如何排除？ 这个问题叫做 emulsion titration，先用小反应去抓出最後多少数目的微珠会被 enrichment，最好的 % 落在 10-20% 之间 (% 意思是 enrichment 之後的微珠除以 最初放入的微珠数)，也就是想要一条 DNA 配一颗微珠，有一条 DNA 你要放 10 到 20 颗微珠，以此类推。 但基本上微珠数量是 kit 里头固定的，你要做的就是算要放入多少数目的 DNA。 这部份需要制作 library 时就用 qPCR 把这个数量算准来。 经过 emulsion titration 之後，你会得到一个 "DNA 数目/微珠数目" 对应到最後 enrichment % 的比率，这个比值最好是会产生出 10-20% enrichment rate 为最佳。 所以简单来说，一条 DNA 接上一个微珠，这样的情形，是利用大量的微珠去稀释掉 DNA 跟微珠的作用力而来的，10-20% 是 Roche 的实验经验法则，也就是说，90% 的 微珠都会被丢掉，没有任何 DNA 在上面，但是剩下 10% 左右的微珠，上面会刚好有 一条 DNA，当然这是理想状态，实际上还是会有一些微珠上面有好几条的，但是比例 较少。 : 以上这两个点我搞不太清楚详情 : 请专业的乡民们替我解答　谢谢>"< 以上～～ 希望能让大家多了解一点 454 的实际操作原理。 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 222.14.252.10