作者jajshigogo (唉唷喂~)
看板Biotech
標題[求救] WB後壓出來的band很weak
時間Thu Jan 10 16:36:06 2013
最近在做WB, protein濃度已經下到200ug了,
結果band還是很weak, 就算是壓tubulin, 也不是很明顯
步驟大概是跑完gel將protein transfer到PVDF membrane後,
用1:5000下一抗(兩種抗體同時壓, 其中一個是tubulin),
室溫作用30-60min, 冰4度o/n,
隔天在下二抗, 室溫作用60min,
再壓片(1小時和2小時)
請問各位大大 是哪裡出了問題?
還是因為抗體壞掉了??
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.114.181.198
1F：推 qiet:2nd Ab titer? 01/10 16:56
2F：推 alaric:先檢查tansfer效率, 個別一抗先試合理titer, 再抓二抗titer 01/10 18:18
3F：→ alaric:舊片, 先用新配二抗再試看看, 不行, 往回檢查. 01/10 18:19
4F：→ blence:用200ug的超多量,又壓片只有1,2h兩時間點,我猜band早燒掉了 01/10 20:30
5F：→ jsi:先跟別人借ECL來用用 01/11 00:43
6F：推 im9527tw:也有可能是顯影劑跟定影劑失效 01/11 10:21
7F：→ joseph103331:燒掉了吧....壓tubulin從沒超過1分鐘 01/13 19:25
8F：→ roy047:200ug tubulin不可能壓不爆qq 也可跟別人借抗體試試 01/13 21:40
9F：→ roy047:也可檢查或重配transfer buffer或TBST 看是否壞掉才壓不到 01/13 21:42
10F：推 datro:你tubulin應該是燒掉了吧!! 01/13 23:59
11F：→ Ice9:washing condition 呢？會不會洗太久或搖太大力了點兒？ 01/15 13:22
12F：→ newmankind:有沒有想過是不是一開始protein定量就有問題 01/23 23:25
13F：→ newmankind:換句話說就是你認為你下到200，其實因為定量時沒有扣掉 01/23 23:27
14F：→ newmankind:background，讓你高估了protein量 01/23 23:28
15F：→ newmankind:會提出這個問題是因為有些測定protein量的KIT 01/23 23:29
16F：→ newmankind:在某些物質存在下，會影響讀值 01/23 23:29