作者jajshigogo (唉唷喂~)
看板Biotech
标题[求救] WB後压出来的band很weak
时间Thu Jan 10 16:36:06 2013
最近在做WB, protein浓度已经下到200ug了,
结果band还是很weak, 就算是压tubulin, 也不是很明显
步骤大概是跑完gel将protein transfer到PVDF membrane後,
用1:5000下一抗(两种抗体同时压, 其中一个是tubulin),
室温作用30-60min, 冰4度o/n,
隔天在下二抗, 室温作用60min,
再压片(1小时和2小时)
请问各位大大 是哪里出了问题?
还是因为抗体坏掉了??
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.114.181.198
1F：推 qiet:2nd Ab titer? 01/10 16:56
2F：推 alaric:先检查tansfer效率, 个别一抗先试合理titer, 再抓二抗titer 01/10 18:18
3F：→ alaric:旧片, 先用新配二抗再试看看, 不行, 往回检查. 01/10 18:19
4F：→ blence:用200ug的超多量,又压片只有1,2h两时间点,我猜band早烧掉了 01/10 20:30
5F：→ jsi:先跟别人借ECL来用用 01/11 00:43
6F：推 im9527tw:也有可能是显影剂跟定影剂失效 01/11 10:21
7F：→ joseph103331:烧掉了吧....压tubulin从没超过1分钟 01/13 19:25
8F：→ roy047:200ug tubulin不可能压不爆qq 也可跟别人借抗体试试 01/13 21:40
9F：→ roy047:也可检查或重配transfer buffer或TBST 看是否坏掉才压不到 01/13 21:42
10F：推 datro:你tubulin应该是烧掉了吧!! 01/13 23:59
11F：→ Ice9:washing condition 呢？会不会洗太久或摇太大力了点儿？ 01/15 13:22
12F：→ newmankind:有没有想过是不是一开始protein定量就有问题 01/23 23:25
13F：→ newmankind:换句话说就是你认为你下到200，其实因为定量时没有扣掉 01/23 23:27
14F：→ newmankind:background，让你高估了protein量 01/23 23:28
15F：→ newmankind:会提出这个问题是因为有些测定protein量的KIT 01/23 23:29
16F：→ newmankind:在某些物质存在下，会影响读值 01/23 23:29