作者ttgsh (寶)
看板Biotech
標題[求救] PCR找不出的盲點
時間Wed Dec 19 12:10:52 2012
遇到PCR的問題
一開始利用dream tag有P的所要的產物
但之後用相同條件，相同機器
就P不到任何東西
PCR產物約2000bp
PCR配方
水 18ul
10x buffer 2.5ul
10mM dNTP 1ul
primer(F) 1ul
primer(R) 1ul
Dream tag 0.5ul
cDNA 1ul
PCR條件:94度 5min
94 30sec
55/50 30sec
72 2min
72 10min
4
Run 35 cycle
目前試過改進的方法有1.增加cDNA的量變成2ul及3ul
2.降低annealing temperature(EX.55度降為50度)
3.換成2X Master mix的tag
4.換新的cDNA試過~也不行 > <
(sample,primer,水,buffer,PCR machine都一樣)
請教各位厲害人士
還有什麼地方可以改進的??
還是有什麼方法??
謝謝~!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.90.143
1F：→ huuban:cDNA回溶幾次了？ 12/19 12:22
2F：→ a0946113:primer的濃度是? 12/19 12:58
3F：→ nike77114:把P過的Products再拿去P一次試試看 12/19 13:36
4F：→ mzac1b:感覺你是要construct 我覺得你的改進方式太客氣了 @.@ 12/19 13:58
5F：→ mzac1b:2ul-->3ul 才1.5 倍 沒啥感覺... annealing 才換一種溫度.. 12/19 13:59
6F：→ mzac1b:但我覺得cDNA 濃度倒不關鍵 除非degrade 光光 那再多也沒用 12/19 14:00
7F：→ mzac1b:狠一點就跑gradient50~70，cycle 40甚至60也ok 反正就硬p 12/19 14:01
8F：→ mzac1b:溫度也不一定降低就比較容易p 出來 12/19 14:03
9F：→ ttgsh:cDNA回溶約三次，primer是10uM 12/19 14:20
10F：→ ttgsh:p過的產物有在去p過~ 是有p出來~ 但是產物用完了就再也P不出 12/19 14:21
11F：→ ttgsh:我是要做construct沒錯~ 12/19 14:21
12F：→ ttgsh:但50度已經是實驗室可以接受的最低溫度了 12/19 14:22
13F：→ ttgsh:所以溫度不能再低了> < 12/19 14:23
14F：→ ttgsh:現在就是硬p也p不出來~ 12/19 14:23
15F：→ ttgsh:而且之前在55度有p出來，可是之後都P不出來 12/19 14:26
※ 編輯: ttgsh 來自: 163.25.90.143 (12/19 14:31)
16F：推 leoblack:你的水是滅過菌的水嘛?! 12/19 14:54
17F：→ huuban:有看過cDNA做不好結果用沒幾次就掛掉的 12/19 16:37
18F：→ keyray:依經驗來看.應該要先確認一下cDNA是否有出問題 12/19 17:27
19F：→ keyray:畢竟p過的產物有p出來,就可以排除掉condition的問題 12/19 17:29
20F：→ a0946113:cDNA跑個control看看 12/19 17:30
21F：→ ttgsh:水是滅過的呀!!! 12/19 17:35
22F：→ ttgsh:嗯嗯~ 謝謝!! 我會先確認cDNA是否有問題~ 12/19 17:37
23F：→ jsi:enzyme還健在嗎? PCR都沒有做positive control嗎? 12/19 23:16
24F：→ huuban:推樓上，其他positive control都ok嗎？ 12/20 01:34
25F：推 afresh72:奇怪，怎麼都沒有人懷疑你的primer是不是設計有錯誤嗎？ 12/20 02:26
26F：→ afresh72:建議你再找人幫你確認看看你的primer有沒有錯。 12/20 02:26
27F：→ afresh72:另外，有些公司訂製的primer也可能出錯，就P不出產物。 12/20 02:27
28F：→ blence:樓上沒看到原po先有P到,相同條件後來卻失敗,怎會懷疑primer 12/20 02:52
29F：→ wangba:primer有沒有可能degrade? 12/20 04:48
30F：→ ttgsh:enzymeg是新開封的~ 應該是不會有問題 12/20 10:25
31F：→ ttgsh:control有做過~ 也都OK!! 12/20 10:26
32F：→ ttgsh:是基因全長不知為何突然p不出來~ 12/20 10:28
33F：→ ttgsh:但換成同基因產物較短的primer就可以p出來~ 12/20 10:28
34F：→ a90648:這樣看來應該是舊primer掛掉了吧 12/20 11:32
35F：→ a90648:既然想找出哪邊有錯，能換新的就應該全換過啊 12/20 11:32
36F：→ ttgsh:能換新的我都換過了沒錯~ primer也重新回溶過 12/20 11:52
37F：→ ttgsh:所以想說先重新抽RNA轉cDNA試試 12/20 11:53
38F：推 dennisyoung7:把elongation的時間從兩分鐘加長到兩分半或三分鐘呢? 12/22 20:55
39F：推 mfliymh:我遇過PCR buffer壞掉... 12/29 11:50