作者ttgsh (宝)
看板Biotech
标题[求救] PCR找不出的盲点
时间Wed Dec 19 12:10:52 2012
遇到PCR的问题
一开始利用dream tag有P的所要的产物
但之後用相同条件，相同机器
就P不到任何东西
PCR产物约2000bp
PCR配方
水 18ul
10x buffer 2.5ul
10mM dNTP 1ul
primer(F) 1ul
primer(R) 1ul
Dream tag 0.5ul
cDNA 1ul
PCR条件:94度 5min
94 30sec
55/50 30sec
72 2min
72 10min
4
Run 35 cycle
目前试过改进的方法有1.增加cDNA的量变成2ul及3ul
2.降低annealing temperature(EX.55度降为50度)
3.换成2X Master mix的tag
4.换新的cDNA试过~也不行 > <
(sample,primer,水,buffer,PCR machine都一样)
请教各位厉害人士
还有什麽地方可以改进的??
还是有什麽方法??
谢谢~!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.90.143
1F：→ huuban:cDNA回溶几次了？ 12/19 12:22
2F：→ a0946113:primer的浓度是? 12/19 12:58
3F：→ nike77114:把P过的Products再拿去P一次试试看 12/19 13:36
4F：→ mzac1b:感觉你是要construct 我觉得你的改进方式太客气了 @.@ 12/19 13:58
5F：→ mzac1b:2ul-->3ul 才1.5 倍 没啥感觉... annealing 才换一种温度.. 12/19 13:59
6F：→ mzac1b:但我觉得cDNA 浓度倒不关键 除非degrade 光光 那再多也没用 12/19 14:00
7F：→ mzac1b:狠一点就跑gradient50~70，cycle 40甚至60也ok 反正就硬p 12/19 14:01
8F：→ mzac1b:温度也不一定降低就比较容易p 出来 12/19 14:03
9F：→ ttgsh:cDNA回溶约三次，primer是10uM 12/19 14:20
10F：→ ttgsh:p过的产物有在去p过~ 是有p出来~ 但是产物用完了就再也P不出 12/19 14:21
11F：→ ttgsh:我是要做construct没错~ 12/19 14:21
12F：→ ttgsh:但50度已经是实验室可以接受的最低温度了 12/19 14:22
13F：→ ttgsh:所以温度不能再低了> < 12/19 14:23
14F：→ ttgsh:现在就是硬p也p不出来~ 12/19 14:23
15F：→ ttgsh:而且之前在55度有p出来，可是之後都P不出来 12/19 14:26
※ 编辑: ttgsh 来自: 163.25.90.143 (12/19 14:31)
16F：推 leoblack:你的水是灭过菌的水嘛?! 12/19 14:54
17F：→ huuban:有看过cDNA做不好结果用没几次就挂掉的 12/19 16:37
18F：→ keyray:依经验来看.应该要先确认一下cDNA是否有出问题 12/19 17:27
19F：→ keyray:毕竟p过的产物有p出来,就可以排除掉condition的问题 12/19 17:29
20F：→ a0946113:cDNA跑个control看看 12/19 17:30
21F：→ ttgsh:水是灭过的呀!!! 12/19 17:35
22F：→ ttgsh:嗯嗯~ 谢谢!! 我会先确认cDNA是否有问题~ 12/19 17:37
23F：→ jsi:enzyme还健在吗? PCR都没有做positive control吗? 12/19 23:16
24F：→ huuban:推楼上，其他positive control都ok吗？ 12/20 01:34
25F：推 afresh72:奇怪，怎麽都没有人怀疑你的primer是不是设计有错误吗？ 12/20 02:26
26F：→ afresh72:建议你再找人帮你确认看看你的primer有没有错。 12/20 02:26
27F：→ afresh72:另外，有些公司订制的primer也可能出错，就P不出产物。 12/20 02:27
28F：→ blence:楼上没看到原po先有P到,相同条件後来却失败,怎会怀疑primer 12/20 02:52
29F：→ wangba:primer有没有可能degrade? 12/20 04:48
30F：→ ttgsh:enzymeg是新开封的~ 应该是不会有问题 12/20 10:25
31F：→ ttgsh:control有做过~ 也都OK!! 12/20 10:26
32F：→ ttgsh:是基因全长不知为何突然p不出来~ 12/20 10:28
33F：→ ttgsh:但换成同基因产物较短的primer就可以p出来~ 12/20 10:28
34F：→ a90648:这样看来应该是旧primer挂掉了吧 12/20 11:32
35F：→ a90648:既然想找出哪边有错，能换新的就应该全换过啊 12/20 11:32
36F：→ ttgsh:能换新的我都换过了没错~ primer也重新回溶过 12/20 11:52
37F：→ ttgsh:所以想说先重新抽RNA转cDNA试试 12/20 11:53
38F：推 dennisyoung7:把elongation的时间从两分钟加长到两分半或三分钟呢? 12/22 20:55
39F：推 mfliymh:我遇过PCR buffer坏掉... 12/29 11:50