作者michaelhsien (MichaelHsien)
看板Biotech
標題[方法] 從完整plasmid取得Vector Alone的方法
時間Mon Dec 10 16:31:38 2012
最近取得一個plasmid，裏頭已帶有我要的基因
而此基因是利用
兩種不同的限制切位所接進去的
但是我沒有vector alone作為實驗的control
所以必須將此plasmid的insert剔除
為了取得這個『
空的vector』
請問各位有何較有效率的方法?
我所想到的策略是
將此plasmid進行酶切，以gel extraction取得vector部分...
1.
合成一股帶有此兩限制切位的oligo，酶切後與vector一起Ligation
問題：一般訂購的Oligo
(primer?)為ssDNA，要如何自行處理成dsDNA
(廠商那邊不知道是否能夠幫我解決此問題)
合成的oligo片段很小，酶切後不知是否能順利回收片段
2.
直接將linear的vector進行Ligation
就像平常cloning時，沒有insert的對照組也會些微
self-ligate的情況...
問題：理論上可行，但不知實際效率如何...
不知道這種實驗有何較好的做法呢?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.57.138
※ 編輯: michaelhsien 來自: 120.126.57.138 (12/10 16:32)
1F：推 HEK293:fill-in w/Klenow 12/10 17:00
2F：→ blence:第2點,平常self-ligat通常是vector只單切造成,跟你說的無關 12/10 17:42
3F：→ blence:第1點將兩股ssDNA黏成dsDNA,google會有教做法,很容易做 12/10 17:44
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4F：推 CD133:別擔心，這很容易，先用不同的限制脢把insert切出來，跑膠， 12/11 08:41
5F：→ CD133:elute，把vector用有proofreading的taq(Pfu)，把兩端補齊， 12/11 08:45
6F：→ CD133:最後再做ligation就好了 12/11 08:45
回復
CD133:
此reaction只要buffer, 和pfu就好了? 需要加dNTP嗎?
之前有做過類似的實驗，是A tailing...是用Taq pol做的，須外加dATP
另外，之前好像有kit可以直接做blunt end cloning (類似TA cloning的目的)
其中有個反應，可將sticky end反應成blunt end的步驟
我再去查一下好了，謝謝你給我這個ideal
※ 編輯: michaelhsien 來自: 120.126.57.138 (12/13 10:43)
7F：推 Realthugz:ssDNA? 12/15 14:41
8F：→ Realthugz:喔喔 了解了 12/15 14:41