作者michaelhsien (MichaelHsien)
看板Biotech
标题[方法] 从完整plasmid取得Vector Alone的方法
时间Mon Dec 10 16:31:38 2012
最近取得一个plasmid，里头已带有我要的基因
而此基因是利用
两种不同的限制切位所接进去的
但是我没有vector alone作为实验的control
所以必须将此plasmid的insert剔除
为了取得这个『
空的vector』
请问各位有何较有效率的方法?
我所想到的策略是
将此plasmid进行酶切，以gel extraction取得vector部分...
1.
合成一股带有此两限制切位的oligo，酶切後与vector一起Ligation
问题：一般订购的Oligo
(primer?)为ssDNA，要如何自行处理成dsDNA
(厂商那边不知道是否能够帮我解决此问题)
合成的oligo片段很小，酶切後不知是否能顺利回收片段
2.
直接将linear的vector进行Ligation
就像平常cloning时，没有insert的对照组也会些微
self-ligate的情况...
问题：理论上可行，但不知实际效率如何...
不知道这种实验有何较好的做法呢?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.57.138
※ 编辑: michaelhsien 来自: 120.126.57.138 (12/10 16:32)
1F：推 HEK293:fill-in w/Klenow 12/10 17:00
2F：→ blence:第2点,平常self-ligat通常是vector只单切造成,跟你说的无关 12/10 17:42
3F：→ blence:第1点将两股ssDNA黏成dsDNA,google会有教做法,很容易做 12/10 17:44
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4F：推 CD133:别担心，这很容易，先用不同的限制脢把insert切出来，跑胶， 12/11 08:41
5F：→ CD133:elute，把vector用有proofreading的taq(Pfu)，把两端补齐， 12/11 08:45
6F：→ CD133:最後再做ligation就好了 12/11 08:45
回复
CD133:
此reaction只要buffer, 和pfu就好了? 需要加dNTP吗?
之前有做过类似的实验，是A tailing...是用Taq pol做的，须外加dATP
另外，之前好像有kit可以直接做blunt end cloning (类似TA cloning的目的)
其中有个反应，可将sticky end反应成blunt end的步骤
我再去查一下好了，谢谢你给我这个ideal
※ 编辑: michaelhsien 来自: 120.126.57.138 (12/13 10:43)
7F：推 Realthugz:ssDNA? 12/15 14:41
8F：→ Realthugz:喔喔 了解了 12/15 14:41