作者oCrazyDucko (１１１天後才能發ｍｍ版)
看板Biotech
標題[求救]小片段DNA(100bp)染內染沒東西
時間Mon Dec 10 11:00:44 2012
不好意思 我的載體是pET21a 片段大小約100bp
我利用先前加入的切位(設計時加入)切不到片段
但利用PCR卻p的出來
然後利用其他的內切位 確認
(若有接入為200bp，沒有則只切的下100bp)
切的下200bp的片段
我到底發生什麼事了.....
各位大大謝謝
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◆ From: 140.120.213.240
※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 11:01)
※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 11:01)
1F：推 kaifish:可能只是看不到：1.提高plasmid作用濃度至10ug 12/10 11:34
2F：→ kaifish:2.跑膠時間不要太久，100v for 5~8 mins就先去照膠 12/10 11:35
3F：→ oCrazyDucko:我沒去測過濃度 不過我都是養菌O/N 取3cc 用kit抽 12/10 11:50
請問這樣夠嗎?
※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 11:50)
4F：推 kaifish:pET21a約5.5kb，取1ug去切也只能得到20ng insert 12/10 13:23
5F：→ kaifish:跑膠可能會看不清楚 12/10 13:23
6F：→ kaifish:所以可以試試看提高反應的量 12/10 13:24
7F：→ blence:plasmid夠不夠跟elute體積與拿去切RE的量有關,跟抽幾cc無關 12/10 13:25
恩 這個我知道 可能是太心急了沒交代清楚 真的很不好意思
我可能養大量一點 測看看濃度吧 那可以請問大概要多少ng or ug 100bp
才能看得清楚呢
※ 編輯: oCrazyDucko 來自: 140.120.213.240 (12/10 14:50)
8F：→ blence:一般lab做agarose染EtBr的靈敏度約10ng,內染的膠跑越久EtBr 12/10 17:54
9F：→ blence:會越往上,往下跑的band就更弱更難看到,可以從k板友的算法 12/10 17:55
10F：→ blence:計算若要有目視易見的band,每個well需要切多少plasmid才夠 12/10 17:57
11F：推 leoblack:EtBr外染比內染來得更靈敏,片段小試著用外染看看 12/10 20:55