作者oCrazyDucko (１１１天後才能发ｍｍ版)
看板Biotech
标题[求救]小片段DNA(100bp)染内染没东西
时间Mon Dec 10 11:00:44 2012
不好意思 我的载体是pET21a 片段大小约100bp
我利用先前加入的切位(设计时加入)切不到片段
但利用PCR却p的出来
然後利用其他的内切位 确认
(若有接入为200bp，没有则只切的下100bp)
切的下200bp的片段
我到底发生什麽事了.....
各位大大谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.213.240
※ 编辑: oCrazyDucko 来自: 140.120.213.240 (12/10 11:01)
※ 编辑: oCrazyDucko 来自: 140.120.213.240 (12/10 11:01)
1F：推 kaifish:可能只是看不到：1.提高plasmid作用浓度至10ug 12/10 11:34
2F：→ kaifish:2.跑胶时间不要太久，100v for 5~8 mins就先去照胶 12/10 11:35
3F：→ oCrazyDucko:我没去测过浓度 不过我都是养菌O/N 取3cc 用kit抽 12/10 11:50
请问这样够吗?
※ 编辑: oCrazyDucko 来自: 140.120.213.240 (12/10 11:50)
4F：推 kaifish:pET21a约5.5kb，取1ug去切也只能得到20ng insert 12/10 13:23
5F：→ kaifish:跑胶可能会看不清楚 12/10 13:23
6F：→ kaifish:所以可以试试看提高反应的量 12/10 13:24
7F：→ blence:plasmid够不够跟elute体积与拿去切RE的量有关,跟抽几cc无关 12/10 13:25
恩 这个我知道 可能是太心急了没交代清楚 真的很不好意思
我可能养大量一点 测看看浓度吧 那可以请问大概要多少ng or ug 100bp
才能看得清楚呢
※ 编辑: oCrazyDucko 来自: 140.120.213.240 (12/10 14:50)
8F：→ blence:一般lab做agarose染EtBr的灵敏度约10ng,内染的胶跑越久EtBr 12/10 17:54
9F：→ blence:会越往上,往下跑的band就更弱更难看到,可以从k板友的算法 12/10 17:55
10F：→ blence:计算若要有目视易见的band,每个well需要切多少plasmid才够 12/10 17:57
11F：推 leoblack:EtBr外染比内染来得更灵敏,片段小试着用外染看看 12/10 20:55