作者sunnyshine ( )
看板Biotech
標題[求救] SNP 限制酶切(CAPS)相關問題
時間Wed Nov 7 18:26:03 2012
想請問一下大家
目前在做SNP相關的實驗 想利用限制酶的方法來確認是否有SNP
primer設計好了 也放下去PCR了 但是在加了限制酶後去跑膠 pattern變得很霧
我的方法是PCR完後 直接加酵素和buffer 37度作用2小時候跑膠
不知道這邊是不是有什麼其他要注意的地方
還是應該先跑膠elute後再酵素切
希望有經驗的人可以幫忙指點迷津~~
謝謝喔!!!
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◆ From: 140.116.235.106
1F：推 HEK293:你怎麼知道有沒有amplification?? buffer環境也不同阿 11/07 18:26
2F：→ HEK293:最少也clean up或是EtOH precipitation吧~ 11/07 18:27
3F：→ HEK293:然後膠是跑幾%？產物多大？ 11/07 18:28
4F：→ sunnyshine:是要純化最好沒錯，不知道有沒有簡便的方法呢??因為實 11/07 18:31
5F：→ sunnyshine:驗室在這邊都沒有相關經驗。膠是做2% 產物是兩百bp 11/07 18:32
6F：→ sunnyshine:切完大概要往下掉20幾個bp 11/07 18:33
7F：→ blence:你不是要簡便方法,而是要自己試條件,請先確認PCR完產物狀況 11/07 20:09
8F：→ blence:產物品質不好,或不是單一band,後續怎麼做? 另外PCR產物直接 11/07 20:11
9F：→ blence:切RE還要考量產物的salt等對於RE作用的影響或改變RE專一性 11/07 20:12
10F：→ blence:請先PCR產量最佳化後取極少體積切RE,這樣才能達到要的效果 11/07 20:14
11F：推 aceliang:我不懂做實驗為什麼要考慮「簡便」，而不是正確性。 11/07 20:28
12F：→ sunnyshine:有同時做一組control確定產物是沒問題的，單一band,大 11/07 21:05
13F：→ sunnyshine:小也是對的! 會提到"簡便"是因為後續檢體會很多，想了 11/07 21:06
14F：→ sunnyshine:解是否在這方面大家是怎麼去克服的或是直接點出我錯誤 11/07 21:10
15F：→ yaprint:切酵素的buffer環境會造成專一性改變，有些酵素會變成亂切 11/07 21:11
16F：→ yaprint:NEB酵素的網頁都會有些特別提醒喔！ 11/07 21:12
17F：→ sunnyshine:的作法!謝謝大家喔所以原理上PCR產物不能直接酵素切喔? 11/07 21:13
18F：→ blence:在目前SNParray或MALDI-TOF等大規模定SNP年代以前,傳統都是 11/07 21:25
19F：→ blence:直接把PCR產物拿去切RE,沒那麼多時間純化,不過都要花時間試 11/07 21:26
20F：→ blence:應該說連taqman出來之前都用這樣的PCR-RFLP看SNP的 11/07 21:28
21F：推 qiet:你取多少PCR product去切? 可能PCR buffer中的鹽離子會影響 11/08 01:21
22F：→ qiet:到RE的反應 反應的體積也要注意 避免star effect... 11/08 01:23
23F：→ qiet:PCR產物直接切是OK的 11/08 01:25
24F：推 HEK293:稀釋倍數要試條件，如果是已經確定pattern，就免純化 11/08 09:13
25F：→ sunnyshine:PCR出來的總體積是25ul，我取10出來切，體積補到20ul去 11/09 14:44
26F：→ sunnyshine:酵素反應，剩下10ul當control；昨天試過用純化，的確 11/09 14:44
27F：→ sunnyshine:band看起來很OK，可是重點...他沒切 囧，跟control比， 11/09 14:46
28F：→ sunnyshine:不但沒切還往上shift一點，請問是因為鹽離子影響嗎?還 11/09 14:47
29F：→ sunnyshine:是??? 囧囧囧 11/09 14:49
30F：推 qiet:RE buffer中鹽離子的關係會影響到跑膠的pattern 11/10 15:23