作者sunnyshine ( )
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标题[求救] SNP 限制酶切(CAPS)相关问题
时间Wed Nov 7 18:26:03 2012
想请问一下大家
目前在做SNP相关的实验 想利用限制酶的方法来确认是否有SNP
primer设计好了 也放下去PCR了 但是在加了限制酶後去跑胶 pattern变得很雾
我的方法是PCR完後 直接加酵素和buffer 37度作用2小时候跑胶
不知道这边是不是有什麽其他要注意的地方
还是应该先跑胶elute後再酵素切
希望有经验的人可以帮忙指点迷津~~
谢谢喔!!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.235.106
1F：推 HEK293:你怎麽知道有没有amplification?? buffer环境也不同阿 11/07 18:26
2F：→ HEK293:最少也clean up或是EtOH precipitation吧~ 11/07 18:27
3F：→ HEK293:然後胶是跑几%？产物多大？ 11/07 18:28
4F：→ sunnyshine:是要纯化最好没错，不知道有没有简便的方法呢??因为实 11/07 18:31
5F：→ sunnyshine:验室在这边都没有相关经验。胶是做2% 产物是两百bp 11/07 18:32
6F：→ sunnyshine:切完大概要往下掉20几个bp 11/07 18:33
7F：→ blence:你不是要简便方法,而是要自己试条件,请先确认PCR完产物状况 11/07 20:09
8F：→ blence:产物品质不好,或不是单一band,後续怎麽做? 另外PCR产物直接 11/07 20:11
9F：→ blence:切RE还要考量产物的salt等对於RE作用的影响或改变RE专一性 11/07 20:12
10F：→ blence:请先PCR产量最佳化後取极少体积切RE,这样才能达到要的效果 11/07 20:14
11F：推 aceliang:我不懂做实验为什麽要考虑「简便」，而不是正确性。 11/07 20:28
12F：→ sunnyshine:有同时做一组control确定产物是没问题的，单一band,大 11/07 21:05
13F：→ sunnyshine:小也是对的! 会提到"简便"是因为後续检体会很多，想了 11/07 21:06
14F：→ sunnyshine:解是否在这方面大家是怎麽去克服的或是直接点出我错误 11/07 21:10
15F：→ yaprint:切酵素的buffer环境会造成专一性改变，有些酵素会变成乱切 11/07 21:11
16F：→ yaprint:NEB酵素的网页都会有些特别提醒喔！ 11/07 21:12
17F：→ sunnyshine:的作法!谢谢大家喔所以原理上PCR产物不能直接酵素切喔? 11/07 21:13
18F：→ blence:在目前SNParray或MALDI-TOF等大规模定SNP年代以前,传统都是 11/07 21:25
19F：→ blence:直接把PCR产物拿去切RE,没那麽多时间纯化,不过都要花时间试 11/07 21:26
20F：→ blence:应该说连taqman出来之前都用这样的PCR-RFLP看SNP的 11/07 21:28
21F：推 qiet:你取多少PCR product去切? 可能PCR buffer中的盐离子会影响 11/08 01:21
22F：→ qiet:到RE的反应 反应的体积也要注意 避免star effect... 11/08 01:23
23F：→ qiet:PCR产物直接切是OK的 11/08 01:25
24F：推 HEK293:稀释倍数要试条件，如果是已经确定pattern，就免纯化 11/08 09:13
25F：→ sunnyshine:PCR出来的总体积是25ul，我取10出来切，体积补到20ul去 11/09 14:44
26F：→ sunnyshine:酵素反应，剩下10ul当control；昨天试过用纯化，的确 11/09 14:44
27F：→ sunnyshine:band看起来很OK，可是重点...他没切 囧，跟control比， 11/09 14:46
28F：→ sunnyshine:不但没切还往上shift一点，请问是因为盐离子影响吗?还 11/09 14:47
29F：→ sunnyshine:是??? 囧囧囧 11/09 14:49
30F：推 qiet:RE buffer中盐离子的关系会影响到跑胶的pattern 11/10 15:23