作者pent (愛、失敗、死亡)
看板Biotech
標題[求救]in situ for crysection slide
時間Mon Nov 5 16:41:48 2012
實驗室的protocol是用石臘包埋的slide做ISH(in situ hybridization)
大致作法如下，
殺老鼠，用DEPC-PBS perfuse, 4% PFA(depc水配製) fix, 4%PFA泡overnight(~16hr)
再泡在50%酒精，送包埋，切片，拿到slide，脫臘，
接著 depc-pbs 洗三次，
0.2N HCl 20min
depc-pbs*3, proteanase K RT treatment, 再洗三次，4%PFA fix, 洗三次
Triethanolamine(TEA) buffer+acetic anhydride treat RT 10min
再洗三次(DEPC-PBS)
pre-hybridization 58。C 1-2hr
DIG-probe 58。C hybridization, 第一天結束
第二天，2X SSC/50% formamide 65度C wash 15min*2
1X SSC/50% formamide 65度C wash 30min*2
接下來就是用 anti-DIG的antibody from Roche 1:500去認
2% NBT/BCIP呈色, 大概要等15-30分鐘才有顏色吧
sample 是心臟，
我用cryosection slide做不出來連positive control 也沒顏色
後來看到一篇current protocol，
它把cryosection slide，先用4%PFA RT 先固定20min
DEPC-PBS wash *3, 接著30%, 60%, 80%, 90%, 100%酒精2min treat,
它說這樣可以固定tissue，
並且，我在版上找到，dehydration和rehydration可以增加組織的通透性，
所以我也有試了一次，依然失敗，依然連positive control都沒訊號
我真的想不出有哪個地方有問題，probe是同事幾個月前合的 RNA probe
用in vitro transcription做出來的
一、兩個月前，實驗室的人用石臘包埋的心臟組織還是做的出來
cryosection的sample要怎麼做ISH呢？
這些步驟有沒有哪裡有漏，
懇請版上的高手救救我
thanks
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.72
1F：推 milkpa:probe還活著嗎？先做dot測測看 11/05 17:03
2F：→ pent:用PVDF或是3M paper做都可以嘛？我老闆叫我試NBT/BCIP and 11/05 22:15
3F：→ pent:anti-DIG，我在paper或PVDF上都有看到變紫。 11/05 22:15
4F：→ pent:so 先點probe在加Ab and NBT??? 11/05 22:16