作者pent (爱、失败、死亡)
看板Biotech
标题[求救]in situ for crysection slide
时间Mon Nov 5 16:41:48 2012
实验室的protocol是用石腊包埋的slide做ISH(in situ hybridization)
大致作法如下，
杀老鼠，用DEPC-PBS perfuse, 4% PFA(depc水配制) fix, 4%PFA泡overnight(~16hr)
再泡在50%酒精，送包埋，切片，拿到slide，脱腊，
接着 depc-pbs 洗三次，
0.2N HCl 20min
depc-pbs*3, proteanase K RT treatment, 再洗三次，4%PFA fix, 洗三次
Triethanolamine(TEA) buffer+acetic anhydride treat RT 10min
再洗三次(DEPC-PBS)
pre-hybridization 58。C 1-2hr
DIG-probe 58。C hybridization, 第一天结束
第二天，2X SSC/50% formamide 65度C wash 15min*2
1X SSC/50% formamide 65度C wash 30min*2
接下来就是用 anti-DIG的antibody from Roche 1:500去认
2% NBT/BCIP呈色, 大概要等15-30分钟才有颜色吧
sample 是心脏，
我用cryosection slide做不出来连positive control 也没颜色
後来看到一篇current protocol，
它把cryosection slide，先用4%PFA RT 先固定20min
DEPC-PBS wash *3, 接着30%, 60%, 80%, 90%, 100%酒精2min treat,
它说这样可以固定tissue，
并且，我在版上找到，dehydration和rehydration可以增加组织的通透性，
所以我也有试了一次，依然失败，依然连positive control都没讯号
我真的想不出有哪个地方有问题，probe是同事几个月前合的 RNA probe
用in vitro transcription做出来的
一、两个月前，实验室的人用石腊包埋的心脏组织还是做的出来
cryosection的sample要怎麽做ISH呢？
这些步骤有没有哪里有漏，
恳请版上的高手救救我
thanks
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.72
1F：推 milkpa:probe还活着吗？先做dot测测看 11/05 17:03
2F：→ pent:用PVDF或是3M paper做都可以嘛？我老板叫我试NBT/BCIP and 11/05 22:15
3F：→ pent:anti-DIG，我在paper或PVDF上都有看到变紫。 11/05 22:15
4F：→ pent:so 先点probe在加Ab and NBT??? 11/05 22:16