作者skyofsilver (silversky)
看板Biotech
標題[求救] protein已定量但actin卻不equal?
時間Tue Oct 30 21:31:20 2012
各位大大好:
近來我在收取Western blot所需的細胞lysate後 以Bio-rad protein assay這組kit進行
定量後發現actin還是不甚equal 仍須用肉眼判定量的多寡來微調
想問一下是不是我實驗的哪個步驟出了問題
我所使用的藥物是會導致細胞死亡的藥物 最高劑量大概可以使整盤p10的細胞死亡60~70%
而我收取lysate的步驟如下:
=> 用細胞刮勺將細胞刮下後 連上液(medium)一同加入離心管中
=> 將細胞離心下來之後 PBS wash一次
=> 細胞pellet加入 HNTG lysis buffer回溶(此步加入protease inhibitor)
=> 冰負80度C 一小時以上或overnight後 放在4度C shaker上搖晃一小時
=> 13000rpm 30分鐘
=> 取上液負20度C保存
定量步驟如下:
使用BCA標準品 0.125, 0.25, 0.5mg/ml 並使用ddH2O當作blank
Sample四倍稀釋 18ul ddH2O + 6ul sample
每一well加入10ul 並加入200ul Bio-rad protein assay 抽吸15次確保mix均勻
使用ELISA reader 570nm測定
在之後的計算中 我每次蛋白質的定量在標準品所畫出來的公式線r平方值都在99以上
但是換算出來後 使用Western去看 發現actin還是不太equal 尤其是加藥高劑量的那一組
想請問是不是在我收lysate的過程中有哪一步驟是錯誤的導致裡面有其他蛋白也跟kit反
應而被定量到了呢?
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◆ From: 218.173.33.127
1F：→ skyofsilver:定量前sample都有vortex並spin down 10/30 21:32
2F：推 chench0710:我想到幾個可能原因: 10/30 21:46
3F：→ chench0710:1.藥物會影響定量試劑(甚至是被算進蛋白質濃度? 10/30 21:47
4F：→ chench0710:2.你的藥物會破壞actin~~!可喜可賀!發篇大的吧! 10/30 21:47
5F：→ skyofsilver:我之前也有懷疑過~ 不過有壓tubulin 走向跟actin是差 10/30 22:04
6F：→ skyofsilver:不多的~ 10/30 22:04
7F：→ skyofsilver:如果是藥物的關係 是要增加PBS wash次數嗎? 10/30 22:04
8F：推 sisley:我也常常遇到藥物treat過後的actin都不準 @@ 目前無解 10/31 00:02
9F：→ blence:連medium的死細胞也一起收就會這樣,沒必要不需要這樣收 10/31 00:12
10F：→ blence:還有把離心後的上清液凍在-20是很不好的,怎樣這種protocol 10/31 00:17
11F：→ raiyu:換別的internal control呢? 我們有些會影響tubulin的藥物 WB 10/31 00:20
12F：→ raiyu:的internal control是用GAPDH 10/31 00:20
13F：推 jsi:可做其他種類的internal control看看,不過我猜結果應該是差不 10/31 00:25
14F：→ jsi:多，加藥實驗常會遇到這種狀況，如果你要呈現蛋白定量一致的WB 10/31 00:28
15F：→ jsi:圖，可用軟體對band進行相對定量來比較。若想要以相同的actin 10/31 00:29
16F：→ jsi:band WB圖顯示，那就得在進行第一次WB之後目測或軟體測band， 10/31 00:31
17F：→ jsi:再微調下次loading量。雖然我覺得這個方法有點爭議，但很多人 10/31 00:34
18F：→ jsi:是這麼做。幸好一篇paper通常會用數種方法來證明論點，所以我 10/31 00:36
19F：→ jsi:就還可以接受這爭議的方法。 10/31 00:37
20F：→ skyofsilver:我們現在是採用j大的方法 另外離心後的上液就是lysate 10/31 01:04
21F：→ skyofsilver:了阿 應該是凍負20度C沒錯吧? 10/31 01:04
22F：→ Ice9:零下80度凍一段時間，很多蛋白的量都會改變，你覺得零下20度 10/31 12:54
23F：→ Ice9:會比較保險嗎？ 有些時候，解凍完的蛋白，我們會重新定量。 10/31 12:55
24F：推 tsubasawolfy:每次wb前都重新定量一次是比較保險 而且要分裝-80 11/01 10:30
25F：→ skyofsilver:感恩~ 11/02 00:10
26F：推 mesenchymal:基本上原因就是細胞死太多的關係 11/06 09:15
27F：→ skyofsilver:所以死掉的細胞會有多的蛋白質被定量到囉? 11/18 02:02