作者skyofsilver (silversky)
看板Biotech
标题[求救] protein已定量但actin却不equal?
时间Tue Oct 30 21:31:20 2012
各位大大好:
近来我在收取Western blot所需的细胞lysate後 以Bio-rad protein assay这组kit进行
定量後发现actin还是不甚equal 仍须用肉眼判定量的多寡来微调
想问一下是不是我实验的哪个步骤出了问题
我所使用的药物是会导致细胞死亡的药物 最高剂量大概可以使整盘p10的细胞死亡60~70%
而我收取lysate的步骤如下:
=> 用细胞刮勺将细胞刮下後 连上液(medium)一同加入离心管中
=> 将细胞离心下来之後 PBS wash一次
=> 细胞pellet加入 HNTG lysis buffer回溶(此步加入protease inhibitor)
=> 冰负80度C 一小时以上或overnight後 放在4度C shaker上摇晃一小时
=> 13000rpm 30分钟
=> 取上液负20度C保存
定量步骤如下:
使用BCA标准品 0.125, 0.25, 0.5mg/ml 并使用ddH2O当作blank
Sample四倍稀释 18ul ddH2O + 6ul sample
每一well加入10ul 并加入200ul Bio-rad protein assay 抽吸15次确保mix均匀
使用ELISA reader 570nm测定
在之後的计算中 我每次蛋白质的定量在标准品所画出来的公式线r平方值都在99以上
但是换算出来後 使用Western去看 发现actin还是不太equal 尤其是加药高剂量的那一组
想请问是不是在我收lysate的过程中有哪一步骤是错误的导致里面有其他蛋白也跟kit反
应而被定量到了呢?
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 218.173.33.127
1F：→ skyofsilver:定量前sample都有vortex并spin down 10/30 21:32
2F：推 chench0710:我想到几个可能原因: 10/30 21:46
3F：→ chench0710:1.药物会影响定量试剂(甚至是被算进蛋白质浓度? 10/30 21:47
4F：→ chench0710:2.你的药物会破坏actin~~!可喜可贺!发篇大的吧! 10/30 21:47
5F：→ skyofsilver:我之前也有怀疑过~ 不过有压tubulin 走向跟actin是差 10/30 22:04
6F：→ skyofsilver:不多的~ 10/30 22:04
7F：→ skyofsilver:如果是药物的关系 是要增加PBS wash次数吗? 10/30 22:04
8F：推 sisley:我也常常遇到药物treat过後的actin都不准 @@ 目前无解 10/31 00:02
9F：→ blence:连medium的死细胞也一起收就会这样,没必要不需要这样收 10/31 00:12
10F：→ blence:还有把离心後的上清液冻在-20是很不好的,怎样这种protocol 10/31 00:17
11F：→ raiyu:换别的internal control呢? 我们有些会影响tubulin的药物 WB 10/31 00:20
12F：→ raiyu:的internal control是用GAPDH 10/31 00:20
13F：推 jsi:可做其他种类的internal control看看,不过我猜结果应该是差不 10/31 00:25
14F：→ jsi:多，加药实验常会遇到这种状况，如果你要呈现蛋白定量一致的WB 10/31 00:28
15F：→ jsi:图，可用软体对band进行相对定量来比较。若想要以相同的actin 10/31 00:29
16F：→ jsi:band WB图显示，那就得在进行第一次WB之後目测或软体测band， 10/31 00:31
17F：→ jsi:再微调下次loading量。虽然我觉得这个方法有点争议，但很多人 10/31 00:34
18F：→ jsi:是这麽做。幸好一篇paper通常会用数种方法来证明论点，所以我 10/31 00:36
19F：→ jsi:就还可以接受这争议的方法。 10/31 00:37
20F：→ skyofsilver:我们现在是采用j大的方法 另外离心後的上液就是lysate 10/31 01:04
21F：→ skyofsilver:了阿 应该是冻负20度C没错吧? 10/31 01:04
22F：→ Ice9:零下80度冻一段时间，很多蛋白的量都会改变，你觉得零下20度 10/31 12:54
23F：→ Ice9:会比较保险吗？ 有些时候，解冻完的蛋白，我们会重新定量。 10/31 12:55
24F：推 tsubasawolfy:每次wb前都重新定量一次是比较保险 而且要分装-80 11/01 10:30
25F：→ skyofsilver:感恩~ 11/02 00:10
26F：推 mesenchymal:基本上原因就是细胞死太多的关系 11/06 09:15
27F：→ skyofsilver:所以死掉的细胞会有多的蛋白质被定量到罗? 11/18 02:02