作者reporter0124 (reporter)
看板Biotech
標題[求救] 關於western
時間Thu Oct 25 23:12:36 2012
大家好
我想請問一下大家在跑western時,
1.同一片gel最多看幾種蛋白?
2.如果同一片gel同時想看三種蛋白,
分子量分別為110,50,21kD,那acrylamide需要做幾%?
3. 如果同一片gel同時想看2種蛋白,分子量分別為110,21kD那我acrylamide需要做幾%?
4.我的蛋白是從culture cell 中純化出來的,
我想請教大家一般sample至少需要加多少uL(我們實驗室蛋白沒有定量直接取)
5.如果western做出來,壓完片後,同一片膠(3種蛋白),某些蛋白會一大坨,
但某些蛋白的band會一格一格的就很漂亮,遇到這種情形我該如何改進?
非常謝謝大家的回答
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
1F：→ blence:1)看你的剪刀技術與gel大小; 2,3)11.5~12%; 4)適量多退少補 10/25 23:20
我想請問一下,一般都是如何決定acrylamide的%?
如果同一片膠,我想看的蛋白最大是110kD最小是21kD,
我選擇12% 的acrylamide gel...
那110kDa 的那個蛋白transfer完後,量會不會變少?或者通通擠在一起?
謝謝大家的解答
2F：→ blence:5)細胞內各種蛋白本來差異就大,最好的方法只有調整抗體濃度 10/25 23:21
原來是從抗體下手,謝謝你的提醒,我以為把蛋白的量減少就可以解決了
※ 編輯: reporter0124 來自: 210.60.122.200 (10/25 23:34)
3F：推 dhaphy:不知道你們老闆會不會接受這樣 但我們是transfer完 把膜剪 10/25 23:37
4F：→ dhaphy:開分別hy你想要看的蛋白的抗體這樣你就可以調整每個抗體的 10/25 23:37
5F：→ dhaphy:titer 壓片的時候也可以分別壓 才不會有些band粗 有些細 10/25 23:38
6F：→ dhaphy:也因為membrane剪開 所以我們用五金行賣的那種塑膠盒(分一 10/25 23:39
7F：→ dhaphy:一格長條型 一格放一種抗體 體機很小所以很省一抗) 10/25 23:40
我現在的確是這樣做,所以我才能一片gel同時看3種蛋白
只是結果出來後,同一片gel,用抗體去hy,同一片gel有些蛋白的band很粗,甚至一坨,
但有些蛋白的band就剛剛好
你說壓片分開壓?
不是都排在casette裡面,依time cost(1,3,5,15min)一起壓嗎?
※ 編輯: reporter0124 來自: 210.60.122.200 (10/26 02:02)
8F：→ dhaphy:恩恩 在同一個casette一起壓 但是不同蛋白會挑不同的時間點 10/26 02:44
9F：→ henrywang:用gradient gel 會比較漂亮 不一定要同時壓片 先壓量比 10/26 11:02
10F：→ henrywang:較少的蛋白 strip後 再壓量比較多的 可以strip數次都OK 10/26 11:04
11F：推 Nicoleching:你可以跑梯度膠啊…做梯度膠這些就 10/26 13:26