作者reporter0124 (reporter)
看板Biotech
标题[求救] 关於western
时间Thu Oct 25 23:12:36 2012
大家好
我想请问一下大家在跑western时,
1.同一片gel最多看几种蛋白?
2.如果同一片gel同时想看三种蛋白,
分子量分别为110,50,21kD,那acrylamide需要做几%?
3. 如果同一片gel同时想看2种蛋白,分子量分别为110,21kD那我acrylamide需要做几%?
4.我的蛋白是从culture cell 中纯化出来的,
我想请教大家一般sample至少需要加多少uL(我们实验室蛋白没有定量直接取)
5.如果western做出来,压完片後,同一片胶(3种蛋白),某些蛋白会一大坨,
但某些蛋白的band会一格一格的就很漂亮,遇到这种情形我该如何改进?
非常谢谢大家的回答
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
1F：→ blence:1)看你的剪刀技术与gel大小; 2,3)11.5~12%; 4)适量多退少补 10/25 23:20
我想请问一下,一般都是如何决定acrylamide的%?
如果同一片胶,我想看的蛋白最大是110kD最小是21kD,
我选择12% 的acrylamide gel...
那110kDa 的那个蛋白transfer完後,量会不会变少?或者通通挤在一起?
谢谢大家的解答
2F：→ blence:5)细胞内各种蛋白本来差异就大,最好的方法只有调整抗体浓度 10/25 23:21
原来是从抗体下手,谢谢你的提醒,我以为把蛋白的量减少就可以解决了
※ 编辑: reporter0124 来自: 210.60.122.200 (10/25 23:34)
3F：推 dhaphy:不知道你们老板会不会接受这样 但我们是transfer完 把膜剪 10/25 23:37
4F：→ dhaphy:开分别hy你想要看的蛋白的抗体这样你就可以调整每个抗体的 10/25 23:37
5F：→ dhaphy:titer 压片的时候也可以分别压 才不会有些band粗 有些细 10/25 23:38
6F：→ dhaphy:也因为membrane剪开 所以我们用五金行卖的那种塑胶盒(分一 10/25 23:39
7F：→ dhaphy:一格长条型 一格放一种抗体 体机很小所以很省一抗) 10/25 23:40
我现在的确是这样做,所以我才能一片gel同时看3种蛋白
只是结果出来後,同一片gel,用抗体去hy,同一片gel有些蛋白的band很粗,甚至一坨,
但有些蛋白的band就刚刚好
你说压片分开压?
不是都排在casette里面,依time cost(1,3,5,15min)一起压吗?
※ 编辑: reporter0124 来自: 210.60.122.200 (10/26 02:02)
8F：→ dhaphy:恩恩 在同一个casette一起压 但是不同蛋白会挑不同的时间点 10/26 02:44
9F：→ henrywang:用gradient gel 会比较漂亮 不一定要同时压片 先压量比 10/26 11:02
10F：→ henrywang:较少的蛋白 strip後 再压量比较多的 可以strip数次都OK 10/26 11:04
11F：推 Nicoleching:你可以跑梯度胶啊…做梯度胶这些就 10/26 13:26