作者DolphinWendy (小海豚)
看板Biotech
標題關於Cloning construct的困難...
時間Sat Oct 6 22:11:57 2012
各位大大> <
想要向各位求助一下
我現在在做cloning，
問題有以下：
1.digest完後gel extraction濃度超低，都不會超過20ng/uL.....
2.學姊說，儘管我切膠萃取濃度只有19.3ng/uL(我回溶40uL)，
但是vector這樣的濃度已經夠了，然後我的insert是我自己設計的
primer linker(total只有45bp)。既然學姊說vector夠了，我就直
接做下去了，做到ligation，做了n次，試了不同比例都無法成功，
學姊們說，linker的ligation要1:30~1:50....且做ligation時linker
就當作100bp去做計算。
我的vector是7.6kb濃度只有19.3ng/uL，linker是45bp(當作100bp計算),
濃度有320ng/uL(這是做過annealing後的濃度)，如果照學姊們說的比例
(1:30~1:50)這樣linker量要加超多!!!然後我們實驗室是用ligation high，
要和sample 1:1混和，這樣ligation的總體積就超多= =
然後，之後transform加入菌液的體積就要更多，重點是，塗完plate之後，
overnight每次都是空空如也T^T.....做好幾次都這樣，有沒有人可以提供點意見?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 1.162.7.76
1F：推 joseph103331:首先 你digest的時候用多少vector下去切? 10/06 23:11
2F：→ joseph103331:再來 重新檢查insert是否有問題(保險起見) 10/06 23:12
3F：→ joseph103331:然後 那個比例是什麼比例? 是莫耳數比 還是濃度比? 10/06 23:13
4F：→ joseph103331:最後可以換其他ligase做看看 10/06 23:14
5F：推 micocat:linker有PNK嗎 10/06 23:33
6F：推 Realthugz:那vector就拿多一點去切阿... 也花不了你多少時間 10/06 23:49
7F：推 Dusha:我還曾經濃度低到測不出來 硬著頭皮做 最後有成功喔 10/06 23:49
8F：→ Realthugz:ligation挑菌做N次不是更浪費時間 10/06 23:49
9F：推 Realthugz:如果怕gel extraction做不好 試試直接過column或沉澱啦 10/06 23:54
10F：→ blence:依照你的數字怎麼算都是linker要加超少量,至少要再稀釋10倍 10/07 00:08
11F：→ DolphinWendy:因為實驗室學姊們都說回收率低，甚至都要下到10~20ul 10/07 10:35
12F：→ DolphinWendy:學姊們幾乎回收率都很低，所以vector幾乎要下到10~20 10/07 10:36
13F：→ DolphinWendy:至於比例呢，是用[vector]x7.6x量:[linker]x0.1x量 10/07 10:38
14F：→ DolphinWendy:照這樣算linker要加超多吧@@ 10/07 10:40
15F：→ DolphinWendy:vector當然可以多切一點....只是我想找出原因...不然 10/07 10:41
16F：→ DolphinWendy:會越下越多...我之前有在不同實驗室做過cloning， 10/07 10:41
17F：→ DolphinWendy:vector頂多下個3~5ug就夠了，因為回收率夠高 10/07 10:42
18F：→ DolphinWendy:不過之前不是自己設計的linker，而是另外一個切下來 10/07 10:43
19F：→ DolphinWendy:的insert，在這實驗室所設計的linker是很多切位合起 10/07 10:44
20F：→ DolphinWendy:來的，以利後續的步驟。 10/07 10:44
21F：→ DolphinWendy:是ligation做n次，根本沒辦法挑菌，因為根本沒長= = 10/07 10:45
22F：→ DolphinWendy:老闆也叫我直接沉澱直接ligation，但是我覺得不可能. 10/07 10:49
23F：→ DolphinWendy:因為我digest完不要的那一段有2kb多，可是我要接進去 10/07 10:50
24F：→ DolphinWendy:的linker只有45bp，這樣直接沉澱ligate太危險了 10/07 10:51
25F：推 qiet:比例是[vector]x量/7.6:[linker]x量/0.1吧? 10/07 12:11
26F：推 qiet:照你那樣算當然體積會超大 10/07 12:14
27F：推 joseph103331:用除的啦 你加這麼多搞不好通通自接去了.... 10/07 13:33
28F：→ blence:vector只要切0.5~1ug就很夠做了,多切只會造成越多切不乾淨 10/07 14:53
29F：→ blence:濃度20ng/ul很夠了,會做不出來是其他的問題 10/07 14:57
30F：→ DolphinWendy:ㄜ...為什麼之前的實驗室試教我用乘的呢@@ 10/08 00:37
31F：→ a90648:1.你記錯 2.他們教錯 10/08 15:50
32F：推 qiet:那個比例是莫耳數比 不要只記算式~ 10/08 17:22
33F：推 Realthugz:insert短 所以量少但是莫耳數高 10/08 20:47
34F：→ lask:是莫耳數比 所以計算時會出現倒數...但是你要去記意義比較好 10/11 23:25
35F：→ cyken:你的算法根本錯誤，你的insert稀釋10倍來用都還嫌太濃 10/14 22:47
36F：→ cyken:回去重念高中化學再來做實驗 10/14 22:50
37F：→ cyken: ^國中 10/14 22:53