作者DolphinWendy (小海豚)
看板Biotech
标题关於Cloning construct的困难...
时间Sat Oct 6 22:11:57 2012
各位大大> <
想要向各位求助一下
我现在在做cloning，
问题有以下：
1.digest完後gel extraction浓度超低，都不会超过20ng/uL.....
2.学姊说，尽管我切胶萃取浓度只有19.3ng/uL(我回溶40uL)，
但是vector这样的浓度已经够了，然後我的insert是我自己设计的
primer linker(total只有45bp)。既然学姊说vector够了，我就直
接做下去了，做到ligation，做了n次，试了不同比例都无法成功，
学姊们说，linker的ligation要1:30~1:50....且做ligation时linker
就当作100bp去做计算。
我的vector是7.6kb浓度只有19.3ng/uL，linker是45bp(当作100bp计算),
浓度有320ng/uL(这是做过annealing後的浓度)，如果照学姊们说的比例
(1:30~1:50)这样linker量要加超多!!!然後我们实验室是用ligation high，
要和sample 1:1混和，这样ligation的总体积就超多= =
然後，之後transform加入菌液的体积就要更多，重点是，涂完plate之後，
overnight每次都是空空如也T^T.....做好几次都这样，有没有人可以提供点意见?
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 1.162.7.76
1F：推 joseph103331:首先 你digest的时候用多少vector下去切? 10/06 23:11
2F：→ joseph103331:再来 重新检查insert是否有问题(保险起见) 10/06 23:12
3F：→ joseph103331:然後 那个比例是什麽比例? 是莫耳数比 还是浓度比? 10/06 23:13
4F：→ joseph103331:最後可以换其他ligase做看看 10/06 23:14
5F：推 micocat:linker有PNK吗 10/06 23:33
6F：推 Realthugz:那vector就拿多一点去切阿... 也花不了你多少时间 10/06 23:49
7F：推 Dusha:我还曾经浓度低到测不出来 硬着头皮做 最後有成功喔 10/06 23:49
8F：→ Realthugz:ligation挑菌做N次不是更浪费时间 10/06 23:49
9F：推 Realthugz:如果怕gel extraction做不好 试试直接过column或沉淀啦 10/06 23:54
10F：→ blence:依照你的数字怎麽算都是linker要加超少量,至少要再稀释10倍 10/07 00:08
11F：→ DolphinWendy:因为实验室学姊们都说回收率低，甚至都要下到10~20ul 10/07 10:35
12F：→ DolphinWendy:学姊们几乎回收率都很低，所以vector几乎要下到10~20 10/07 10:36
13F：→ DolphinWendy:至於比例呢，是用[vector]x7.6x量:[linker]x0.1x量 10/07 10:38
14F：→ DolphinWendy:照这样算linker要加超多吧@@ 10/07 10:40
15F：→ DolphinWendy:vector当然可以多切一点....只是我想找出原因...不然 10/07 10:41
16F：→ DolphinWendy:会越下越多...我之前有在不同实验室做过cloning， 10/07 10:41
17F：→ DolphinWendy:vector顶多下个3~5ug就够了，因为回收率够高 10/07 10:42
18F：→ DolphinWendy:不过之前不是自己设计的linker，而是另外一个切下来 10/07 10:43
19F：→ DolphinWendy:的insert，在这实验室所设计的linker是很多切位合起 10/07 10:44
20F：→ DolphinWendy:来的，以利後续的步骤。 10/07 10:44
21F：→ DolphinWendy:是ligation做n次，根本没办法挑菌，因为根本没长= = 10/07 10:45
22F：→ DolphinWendy:老板也叫我直接沉淀直接ligation，但是我觉得不可能. 10/07 10:49
23F：→ DolphinWendy:因为我digest完不要的那一段有2kb多，可是我要接进去 10/07 10:50
24F：→ DolphinWendy:的linker只有45bp，这样直接沉淀ligate太危险了 10/07 10:51
25F：推 qiet:比例是[vector]x量/7.6:[linker]x量/0.1吧? 10/07 12:11
26F：推 qiet:照你那样算当然体积会超大 10/07 12:14
27F：推 joseph103331:用除的啦 你加这麽多搞不好通通自接去了.... 10/07 13:33
28F：→ blence:vector只要切0.5~1ug就很够做了,多切只会造成越多切不乾净 10/07 14:53
29F：→ blence:浓度20ng/ul很够了,会做不出来是其他的问题 10/07 14:57
30F：→ DolphinWendy:ㄜ...为什麽之前的实验室试教我用乘的呢@@ 10/08 00:37
31F：→ a90648:1.你记错 2.他们教错 10/08 15:50
32F：推 qiet:那个比例是莫耳数比 不要只记算式~ 10/08 17:22
33F：推 Realthugz:insert短 所以量少但是莫耳数高 10/08 20:47
34F：→ lask:是莫耳数比 所以计算时会出现倒数...但是你要去记意义比较好 10/11 23:25
35F：→ cyken:你的算法根本错误，你的insert稀释10倍来用都还嫌太浓 10/14 22:47
36F：→ cyken:回去重念高中化学再来做实验 10/14 22:50
37F：→ cyken: ^国中 10/14 22:53