作者adamada (soso)
看板Biotech
標題[求救] 回收切過的質體
時間Fri Oct 5 16:55:40 2012
小弟我把pUC19用SmaI切4小時
之後跑膠然後回收!!!
未切跟切過的pUC19有一起跑膠檢查過大小是不一樣的(1.5 kb vs 2.7 kb)
但是如果直接拿切過的pUC19作transformation 到E.coli
結果還是會有大量的菌落..請問這是因為我pUC19沒切好嗎??
還是細菌自己會做ligation.....
亦或我要補做CIP??
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◆ From: 134.76.70.252
1F：→ blence:EtBr下看到未切的位置沒訊號不代表沒pUC19,要考慮影像極限 10/05 17:07
※ 編輯: adamada 來自: 134.76.70.252 (10/05 17:42)
※ 編輯: adamada 來自: 134.76.70.252 (10/05 17:44)
2F：→ adamada:我只有切2.7那邊回收膠所以我不懂blence您的回答?? 10/05 17:45
3F：→ puec2:沒切好 另外enzyme有極限 不應該假設100%都切乾淨 10/05 17:50
4F：→ puec2:所以有的人會喜歡在常用的plasmid的MCS裡面放一段DNA 10/05 17:51
5F：→ puec2:這樣用enzyme切的時候 有切乾淨跟沒切乾淨的位置差很遠 10/05 17:51
6F：→ puec2:用這種方式減少沒有切乾淨的DNA的汙染 10/05 17:52
7F：→ puec2:然後細菌的確會自己做ligation 不然怎麼做DNA repair 10/05 17:53
8F：→ adamada:所以要怎樣做才叫有切好??畢竟切過跟未切過的大小差了1kb. 10/05 18:10
9F：→ blence:不是DNArepair就能end-joining,而且Ecoil的EJ還需要Rec活性 10/05 18:30
10F：推 aceliang:不管怎樣做，都沒有100%切乾淨的可能，切好否看你的定義 10/05 23:06
11F：→ aceliang:切過跟沒切過大小也沒有差，那只是circular/linear差別 10/05 23:06
12F：→ aceliang:你沒看到，不代表膠體內完全不含circular form plasmid 10/05 23:07
13F：推 alaric:我有一個疑問, pUC19有兩個SmaI切位嗎? 10/06 23:46
14F：→ adamada:pUC19只有一個SmaI! 10/07 04:24
15F：推 milkpa:SmaI為blunt end，有看到兩個片段（可能為supercoil）表示 10/07 16:46
16F：→ milkpa:八成沒切乾淨 10/07 16:46
17F：推 alaric:酵素切 O/N 吧. 10/08 12:53
18F：推 hsuwenli:你的pUC19有做過antibiotic的test嗎?你確定colony是pUC19 11/12 22:01