作者adamada (soso)
看板Biotech
标题[求救] 回收切过的质体
时间Fri Oct 5 16:55:40 2012
小弟我把pUC19用SmaI切4小时
之後跑胶然後回收!!!
未切跟切过的pUC19有一起跑胶检查过大小是不一样的(1.5 kb vs 2.7 kb)
但是如果直接拿切过的pUC19作transformation 到E.coli
结果还是会有大量的菌落..请问这是因为我pUC19没切好吗??
还是细菌自己会做ligation.....
亦或我要补做CIP??
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◆ From: 134.76.70.252
1F：→ blence:EtBr下看到未切的位置没讯号不代表没pUC19,要考虑影像极限 10/05 17:07
※ 编辑: adamada 来自: 134.76.70.252 (10/05 17:42)
※ 编辑: adamada 来自: 134.76.70.252 (10/05 17:44)
2F：→ adamada:我只有切2.7那边回收胶所以我不懂blence您的回答?? 10/05 17:45
3F：→ puec2:没切好 另外enzyme有极限 不应该假设100%都切乾净 10/05 17:50
4F：→ puec2:所以有的人会喜欢在常用的plasmid的MCS里面放一段DNA 10/05 17:51
5F：→ puec2:这样用enzyme切的时候 有切乾净跟没切乾净的位置差很远 10/05 17:51
6F：→ puec2:用这种方式减少没有切乾净的DNA的污染 10/05 17:52
7F：→ puec2:然後细菌的确会自己做ligation 不然怎麽做DNA repair 10/05 17:53
8F：→ adamada:所以要怎样做才叫有切好??毕竟切过跟未切过的大小差了1kb. 10/05 18:10
9F：→ blence:不是DNArepair就能end-joining,而且Ecoil的EJ还需要Rec活性 10/05 18:30
10F：推 aceliang:不管怎样做，都没有100%切乾净的可能，切好否看你的定义 10/05 23:06
11F：→ aceliang:切过跟没切过大小也没有差，那只是circular/linear差别 10/05 23:06
12F：→ aceliang:你没看到，不代表胶体内完全不含circular form plasmid 10/05 23:07
13F：推 alaric:我有一个疑问, pUC19有两个SmaI切位吗? 10/06 23:46
14F：→ adamada:pUC19只有一个SmaI! 10/07 04:24
15F：推 milkpa:SmaI为blunt end，有看到两个片段（可能为supercoil）表示 10/07 16:46
16F：→ milkpa:八成没切乾净 10/07 16:46
17F：推 alaric:酵素切 O/N 吧. 10/08 12:53
18F：推 hsuwenli:你的pUC19有做过antibiotic的test吗?你确定colony是pUC19 11/12 22:01