我這陣子有做三批bisulfite的PCR 第一次做try得要死才做出來 後來買了Hotstart的PCR mix 結果後來連anneling溫度都不用測就可以P出專一的band 避免幫廠商打廣告 如果有需要的可以站內信問我是用哪支Taq 希望可以幫到大家 ^^ ※ 引述《travelmat (草蓆)》之銘言： : 其實我也有同樣問題... : 我之前也是有TRY到一個比較好的條件 : 僅管做出來一樣是smear一片，但相對明顯有一條專一性的band(size是我要的) : 本來預期是以為這樣的condition是非常OK的 : 於是接下來的sample嘗試以同樣condition下去跑 : 卻發現不同sample間無法重覆 : 而即使回到一開始的同樣sample也無法repeat : 問過別家有在做類似實驗的，學長給我回應是 : 1.我sampleDNA是GENOMIC，genomic pcr本來就很麻煩又複雜 : 2.每次的BISULFITE處理後都視為不同的sample，也就是每次都可能會有不同的condition : 3.primer suck : 所以就...... : 而我問我們老師，我們老師給的答案是 : PCR就是一項amprify的技術，所以如果你這次primer能bind到正確的位置 : 那麼他理論上就是會放大，bind的相對多，專一性片段就相對亮 : 而bind的沒相對多，於是就一片smear : 簡單來講，以我的情況就是要看運氣，這次運氣好就有專一性這樣。 : 我個人做法是把primer anealing的時間拉長，我的想法是 : 這樣讓primer有比較多的機率去bind到正確的片段(當然非專一性的也可能提高) : 後來用這樣做法的確是相對成功率比較高.... : 不過整體來講還是成功率非常之低....... : 目前是改成將PCR進TA，然後考慮用colony hybridization去抓哪個colony有我要的片段 : (我好想畢業阿.....) : 以上希望對你有幫助.... : 如果你有進展也請分享給我和大家.....感謝你.... --

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