作者sunptt (風)
看板Biotech
標題[求救] ligation求救
時間Fri Sep 14 10:36:26 2012
我的insert約2.7kb, vector 5.9kb doule digest overnight
vector use gel clean(因為切兩刀後會掉下約500bp)
ligation 比例 insert:vector=3:1 , 6:1 於室溫下反應45min~1hr
transformation 加10ul ligation solution到complete cell(市售的)
->冰浴 -> heat shock 90sec -> 冰浴 -> 加LB(不含Amp)培養 ->塗盤
隔天收盤時,每盤約只長不到10顆 而且都不是我要的
有把ligation solution拿去跑膠 看起來都沒有band
感覺是沒有接上去的樣子 = =
有換過另一個vector 兩個切位就在旁邊酵素切完, clean , CIP
收盤時菌落是比較多了 但看起來都是原本的質體 insert 沒有接上去阿 = =
是因為inssert 片段比較長 所以比較不好接嗎?
想請問 有建議的ligation方法(時間.溫度....)嗎??
我已經前前後做了快半年了(中間有在改東西) 做到都快發瘋了 嗚嗚
感謝大家!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.123.126.53
1F：推 conective:1.insert跟vector回收完有測濃度嗎？ 有跑膠嗎？ 09/14 10:47
2F：→ conective:2.ligation可用16度 overnight 09/14 10:47
3F：推 conective:3.一般一管勝任細胞加1-2μL的DNA就夠了 頂多4μl 09/14 10:51
4F：→ conective:10μL貌似太多了點 而且你有recover還是長那麼少蠻怪的 09/14 10:51
5F：→ sunptt:回收完有測濃度,ligation時二者皆>200ng 09/14 11:18
6F：→ Ianthegood:RE site是什麼? 09/14 11:25
7F：推 HEK293:1. ligation的比例是重量還是莫耳數？ 09/14 11:37
8F：→ HEK293:2. 請各個步驟都加做positive control，才能troubleshootin 09/14 11:38
9F：推 leoblack:3:1是指molar ratio,請回算成mole,NEB ligase用16度o/n 09/14 12:52
10F：→ leoblack:fermentas ligase是22度~不要用錯了 09/14 12:52
11F：→ travelmat:勝任細胞效率多少? 抗生素確定沒錯? 抗生素濃度多少? 09/15 22:56
12F：→ blence:"ligation時二者皆>200ng"顯示你們的cloning很多是問題造成 09/17 00:47
13F：→ blence:可能要找其他lab重新從enzyme digest到ligation檢查問題 09/17 00:51
14F：→ sunptt:RE site是XbaI和EcoRI 09/19 10:50
15F：→ sunptt:RE site是XbaI和EcoRI 勝任細胞是買市售的 09/19 10:59
16F：→ sunptt:抗生素濃度為50ug/ml 09/19 11:01
17F：→ sunptt:ligation比例是用莫耳數比 09/19 11:02
18F：→ williamyang:vector會不會XbaI沒切，因為XbaI會切不動dam甲基化的 09/19 21:50
19F：→ williamyang:序列,有先確認過序列了嗎? 09/19 21:50
20F：→ blence:在NEB DDF table, 基本型XbaI跟EcoRI不能一起切...... 09/19 22:17