作者sunptt (风)
看板Biotech
标题[求救] ligation求救
时间Fri Sep 14 10:36:26 2012
我的insert约2.7kb, vector 5.9kb doule digest overnight
vector use gel clean(因为切两刀後会掉下约500bp)
ligation 比例 insert:vector=3:1 , 6:1 於室温下反应45min~1hr
transformation 加10ul ligation solution到complete cell(市售的)
->冰浴 -> heat shock 90sec -> 冰浴 -> 加LB(不含Amp)培养 ->涂盘
隔天收盘时,每盘约只长不到10颗 而且都不是我要的
有把ligation solution拿去跑胶 看起来都没有band
感觉是没有接上去的样子 = =
有换过另一个vector 两个切位就在旁边酵素切完, clean , CIP
收盘时菌落是比较多了 但看起来都是原本的质体 insert 没有接上去阿 = =
是因为inssert 片段比较长 所以比较不好接吗?
想请问 有建议的ligation方法(时间.温度....)吗??
我已经前前後做了快半年了(中间有在改东西) 做到都快发疯了 呜呜
感谢大家!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.123.126.53
1F：推 conective:1.insert跟vector回收完有测浓度吗？ 有跑胶吗？ 09/14 10:47
2F：→ conective:2.ligation可用16度 overnight 09/14 10:47
3F：推 conective:3.一般一管胜任细胞加1-2μL的DNA就够了 顶多4μl 09/14 10:51
4F：→ conective:10μL貌似太多了点 而且你有recover还是长那麽少蛮怪的 09/14 10:51
5F：→ sunptt:回收完有测浓度,ligation时二者皆>200ng 09/14 11:18
6F：→ Ianthegood:RE site是什麽? 09/14 11:25
7F：推 HEK293:1. ligation的比例是重量还是莫耳数？ 09/14 11:37
8F：→ HEK293:2. 请各个步骤都加做positive control，才能troubleshootin 09/14 11:38
9F：推 leoblack:3:1是指molar ratio,请回算成mole,NEB ligase用16度o/n 09/14 12:52
10F：→ leoblack:fermentas ligase是22度~不要用错了 09/14 12:52
11F：→ travelmat:胜任细胞效率多少? 抗生素确定没错? 抗生素浓度多少? 09/15 22:56
12F：→ blence:"ligation时二者皆>200ng"显示你们的cloning很多是问题造成 09/17 00:47
13F：→ blence:可能要找其他lab重新从enzyme digest到ligation检查问题 09/17 00:51
14F：→ sunptt:RE site是XbaI和EcoRI 09/19 10:50
15F：→ sunptt:RE site是XbaI和EcoRI 胜任细胞是买市售的 09/19 10:59
16F：→ sunptt:抗生素浓度为50ug/ml 09/19 11:01
17F：→ sunptt:ligation比例是用莫耳数比 09/19 11:02
18F：→ williamyang:vector会不会XbaI没切，因为XbaI会切不动dam甲基化的 09/19 21:50
19F：→ williamyang:序列,有先确认过序列了吗? 09/19 21:50
20F：→ blence:在NEB DDF table, 基本型XbaI跟EcoRI不能一起切...... 09/19 22:17