作者travelmat (草蓆)
看板Biotech
標題Re: [求救]bisulfite Genomic PCR疑問
時間Thu Sep 6 16:57:34 2012
其實我也有同樣問題...
我之前也是有TRY到一個比較好的條件
僅管做出來一樣是smear一片，但相對明顯有一條專一性的band(size是我要的)
本來預期是以為這樣的condition是非常OK的
於是接下來的sample嘗試以同樣condition下去跑
卻發現不同sample間無法重覆
而即使回到一開始的同樣sample也無法repeat
問過別家有在做類似實驗的，學長給我回應是
1.我sampleDNA是GENOMIC，genomic pcr本來就很麻煩又複雜
2.每次的BISULFITE處理後都視為不同的sample，也就是每次都可能會有不同的condition
3.primer suck
所以就......
而我問我們老師，我們老師給的答案是
PCR就是一項amprify的技術，所以如果你這次primer能bind到正確的位置
那麼他理論上就是會放大，bind的相對多，專一性片段就相對亮
而bind的沒相對多，於是就一片smear
簡單來講，以我的情況就是要看運氣，這次運氣好就有專一性這樣。
我個人做法是把primer anealing的時間拉長，我的想法是
這樣讓primer有比較多的機率去bind到正確的片段(當然非專一性的也可能提高)
後來用這樣做法的確是相對成功率比較高....
不過整體來講還是成功率非常之低.......
目前是改成將PCR進TA，然後考慮用colony hybridization去抓哪個colony有我要的片段
(我好想畢業阿.....)
以上希望對你有幫助....
如果你有進展也請分享給我和大家.....感謝你....
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
1F：→ scherzoinb:我會覺得應該是primer沒有設計好耶~~~ 09/06 20:56
2F：→ scherzoinb:因為bis的treatment...會牽扯到sample中含有C甲基化 09/06 21:02
3F：→ scherzoinb:多少而定...m跟u的primer上設計的差異點就很重要了 09/06 21:05
這部份有考慮過
但因為實在找不到其他PRIMER設計位置了
所以只好繼續用這組
4F：→ scherzoinb:我也在想你BISULFITE的kit是不是有問題... 09/06 21:08
5F：→ scherzoinb:以前我用gDNA經bis處理過後的sample能冰在-20冰箱很久 09/06 21:10
6F：→ scherzoinb:都還是P的出來...我記得以前我有買過control... 09/06 21:14
其實我不是用KIT ㄒ_ㄒ
應該不是 gDNA 壞掉的問題
因為其實還是能P ， 偶爾也會有專一性片段出現(但不是我要的)
只是無法REPEAT之前的DATA而已
推測primer穩定性不夠，也就是專一性不夠之類，所以上面第3點才說 primer suck
7F：→ scherzoinb:某家公司bis處理過的gDNA...當作實驗的對照... 09/06 21:15
8F：→ scherzoinb:P那個對照就一定會有band..來檢視自己的primer有無問題 09/06 21:17
9F：→ scherzoinb:拿bis未處理跟處理過的sample去sequencing...會比較準 09/06 21:19
10F：→ scherzoinb:如果只是檢測用的話...考慮用Q-MSPCR...taqman probe 09/06 21:20
我自己是有做control，確定這組primer是可以用的 (指可以P出我要的片段)
但因為我做的control相對實驗組環境比較單純，所以只能確定primer可用
其他就無法確定了
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (09/07 09:44)