作者travelmat (草蓆)
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标题Re: [求救]bisulfite Genomic PCR疑问
时间Thu Sep 6 16:57:34 2012
其实我也有同样问题...
我之前也是有TRY到一个比较好的条件
仅管做出来一样是smear一片，但相对明显有一条专一性的band(size是我要的)
本来预期是以为这样的condition是非常OK的
於是接下来的sample尝试以同样condition下去跑
却发现不同sample间无法重覆
而即使回到一开始的同样sample也无法repeat
问过别家有在做类似实验的，学长给我回应是
1.我sampleDNA是GENOMIC，genomic pcr本来就很麻烦又复杂
2.每次的BISULFITE处理後都视为不同的sample，也就是每次都可能会有不同的condition
3.primer suck
所以就......
而我问我们老师，我们老师给的答案是
PCR就是一项amprify的技术，所以如果你这次primer能bind到正确的位置
那麽他理论上就是会放大，bind的相对多，专一性片段就相对亮
而bind的没相对多，於是就一片smear
简单来讲，以我的情况就是要看运气，这次运气好就有专一性这样。
我个人做法是把primer anealing的时间拉长，我的想法是
这样让primer有比较多的机率去bind到正确的片段(当然非专一性的也可能提高)
後来用这样做法的确是相对成功率比较高....
不过整体来讲还是成功率非常之低.......
目前是改成将PCR进TA，然後考虑用colony hybridization去抓哪个colony有我要的片段
(我好想毕业阿.....)
以上希望对你有帮助....
如果你有进展也请分享给我和大家.....感谢你....
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
1F：→ scherzoinb:我会觉得应该是primer没有设计好耶~~~ 09/06 20:56
2F：→ scherzoinb:因为bis的treatment...会牵扯到sample中含有C甲基化 09/06 21:02
3F：→ scherzoinb:多少而定...m跟u的primer上设计的差异点就很重要了 09/06 21:05
这部份有考虑过
但因为实在找不到其他PRIMER设计位置了
所以只好继续用这组
4F：→ scherzoinb:我也在想你BISULFITE的kit是不是有问题... 09/06 21:08
5F：→ scherzoinb:以前我用gDNA经bis处理过後的sample能冰在-20冰箱很久 09/06 21:10
6F：→ scherzoinb:都还是P的出来...我记得以前我有买过control... 09/06 21:14
其实我不是用KIT ㄒ_ㄒ
应该不是 gDNA 坏掉的问题
因为其实还是能P ， 偶尔也会有专一性片段出现(但不是我要的)
只是无法REPEAT之前的DATA而已
推测primer稳定性不够，也就是专一性不够之类，所以上面第3点才说 primer suck
7F：→ scherzoinb:某家公司bis处理过的gDNA...当作实验的对照... 09/06 21:15
8F：→ scherzoinb:P那个对照就一定会有band..来检视自己的primer有无问题 09/06 21:17
9F：→ scherzoinb:拿bis未处理跟处理过的sample去sequencing...会比较准 09/06 21:19
10F：→ scherzoinb:如果只是检测用的话...考虑用Q-MSPCR...taqman probe 09/06 21:20
我自己是有做control，确定这组primer是可以用的 (指可以P出我要的片段)
但因为我做的control相对实验组环境比较单纯，所以只能确定primer可用
其他就无法确定了
※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (09/07 09:44)