作者otneiv (oleic)
看板Biotech
標題[求救] miRNA的篩選
時間Mon Sep 3 09:40:54 2012
想請問一下 要如何在萃取出的眾多RNA中 找到自己想要的miRNA?
另外就是 miRNA的長度並沒有很長 在做RT 以及PCR的時候 PRIMER是如何黏貼上去的?
(有查到兩個方法 一個是利用Oligo(T)特異序列的PRIMER
另一個是 利用looped Primer
可是如何能確定做出來的東西是我們想要的 難道不會隨便亂黏嗎?)
最後一個是 SAMPLE裡面的 normalization 是指?
小弟剛進實驗室 然後老闆就丟了個miRNA相關的東西給我
希望我能弄出個大概的實驗流程
(而且實驗室之前也沒有人做過RNA相關 所以也沒有學長姐可以問 Orz)
看了PAPER之後 目前預計的流程應該是:
自SAMPLE萃取RNA (KIT有分 取TOTAL RNA或者是取small RNA 屆時應該是用後者)
↓
反轉成cDNA
↓
real-time PCR
↓
計算Ct值
謝謝指教
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.71.2.84
1F：推 RickyKckao:通常你要先有一個你想看的gene, 再以prediction軟體去 09/03 10:54
2F：→ RickyKckao:預測有哪些miRNA可能target你的gene 09/03 10:54
3F：→ RickyKckao:normalization就是平常說的"標準化"在這裡是指用snoRNA 09/03 10:55
4F：→ RickyKckao:或其他在細胞中表現stable的small RNA作為control 09/03 10:56
5F：→ RickyKckao:我RT用的方法都是looped primer你可以參考TaqMan miRNA 09/03 10:59
6F：→ RickyKckao:assay中RT的介紹 09/03 10:59
7F：推 RickyKckao:prediction軟體在網路上很多, 像是TargetScan, microRN 09/03 11:05
8F：→ RickyKckao:A.org, PicTar.. 等 09/03 11:06
9F：→ RickyKckao:如果sample少的話建議用Ambion的Cell-to-Ct kit來抽RNA 09/03 11:12
10F：→ RickyKckao:從cell lysis到翻RT不像一般需要沉澱或wash, 所以不用 09/03 11:13
11F：→ RickyKckao:擔心會有RNA lose 09/03 11:14
12F：→ RickyKckao:做miRNA所要用的reagent都比較貴, 建議先評估值不值得 09/03 11:16
13F：→ RickyKckao:砸這筆錢下去! 09/03 11:16
14F：推 huuban:先說明你的樣本，不同物種處理方法差很多 09/03 11:40
15F：→ huuban:建議你直接跟幾個大廠產品專員去討論 09/03 11:41
16F：→ huuban:畢竟很多miRNA相關的實驗跟一般實驗用的東西名稱很像 09/03 11:41
17F：→ otneiv:SAMPLE 預計是用唾液以及血液 09/03 13:06
18F：→ RickyKckao:是要看secreted miRNA? 09/03 13:12
19F：→ otneiv:是想看有沒有特異性的miRNA 能代表特定體液 09/03 14:39
20F：→ RickyKckao:或許要做miRNA array.. 09/03 15:10
※ 編輯: otneiv 來自: 203.71.2.84 (09/03 16:20)
21F：→ otneiv:這樣的話 應該要請廠商幫忙? (實驗是好像沒有相關儀器) 09/03 16:23
22F：→ otneiv:而且價格應該不斐 = =a (老闆應該會希望有比較便宜的方法) 09/03 16:28
23F：→ RickyKckao:我之前問過TaqMan miRNA array 四個sample要價八萬 09/03 16:36
24F：→ RickyKckao:多問幾間有在做miRNA array的廠商看看吧! 09/03 16:37
25F：→ otneiv:感謝幫忙!! 我再跟老闆討論看看好了~~ 09/03 16:41
26F：推 HEK293:榮陽也有做Taqman miRNA array，價格差不多就是了Orz 09/03 17:22
27F：→ HEK293:也可以試試mirDIP先做幾個db的比較，做起來比較有信心 09/03 17:23
28F：→ HEK293:其實幾個db的預測結果出入也不小，尤其是PicTar很特立獨行 09/03 17:24
29F：→ windincloud:我想應該是萃取sRNA後跑NGS之類的定序 然後走 09/03 18:12
30F：→ windincloud:deep sequencing 然後再篩出可能的miRNA 09/03 18:15
31F：→ windincloud:通常還會搭你想要看的array去分析patten 09/03 18:16
32F：推 huuban:找已知的用array，有商品化的很好用 09/04 00:12
33F：→ huuban:找未知，解NGS，無論哪種就先學抽RNA，QC過才能往下做 09/04 00:13