作者otneiv (oleic)
看板Biotech
标题[求救] miRNA的筛选
时间Mon Sep 3 09:40:54 2012
想请问一下 要如何在萃取出的众多RNA中 找到自己想要的miRNA?
另外就是 miRNA的长度并没有很长 在做RT 以及PCR的时候 PRIMER是如何黏贴上去的?
(有查到两个方法 一个是利用Oligo(T)特异序列的PRIMER
另一个是 利用looped Primer
可是如何能确定做出来的东西是我们想要的 难道不会随便乱黏吗?)
最後一个是 SAMPLE里面的 normalization 是指?
小弟刚进实验室 然後老板就丢了个miRNA相关的东西给我
希望我能弄出个大概的实验流程
(而且实验室之前也没有人做过RNA相关 所以也没有学长姐可以问 Orz)
看了PAPER之後 目前预计的流程应该是:
自SAMPLE萃取RNA (KIT有分 取TOTAL RNA或者是取small RNA 届时应该是用後者)
↓
反转成cDNA
↓
real-time PCR
↓
计算Ct值
谢谢指教
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 203.71.2.84
1F：推 RickyKckao:通常你要先有一个你想看的gene, 再以prediction软体去 09/03 10:54
2F：→ RickyKckao:预测有哪些miRNA可能target你的gene 09/03 10:54
3F：→ RickyKckao:normalization就是平常说的"标准化"在这里是指用snoRNA 09/03 10:55
4F：→ RickyKckao:或其他在细胞中表现stable的small RNA作为control 09/03 10:56
5F：→ RickyKckao:我RT用的方法都是looped primer你可以参考TaqMan miRNA 09/03 10:59
6F：→ RickyKckao:assay中RT的介绍 09/03 10:59
7F：推 RickyKckao:prediction软体在网路上很多, 像是TargetScan, microRN 09/03 11:05
8F：→ RickyKckao:A.org, PicTar.. 等 09/03 11:06
9F：→ RickyKckao:如果sample少的话建议用Ambion的Cell-to-Ct kit来抽RNA 09/03 11:12
10F：→ RickyKckao:从cell lysis到翻RT不像一般需要沉淀或wash, 所以不用 09/03 11:13
11F：→ RickyKckao:担心会有RNA lose 09/03 11:14
12F：→ RickyKckao:做miRNA所要用的reagent都比较贵, 建议先评估值不值得 09/03 11:16
13F：→ RickyKckao:砸这笔钱下去! 09/03 11:16
14F：推 huuban:先说明你的样本，不同物种处理方法差很多 09/03 11:40
15F：→ huuban:建议你直接跟几个大厂产品专员去讨论 09/03 11:41
16F：→ huuban:毕竟很多miRNA相关的实验跟一般实验用的东西名称很像 09/03 11:41
17F：→ otneiv:SAMPLE 预计是用唾液以及血液 09/03 13:06
18F：→ RickyKckao:是要看secreted miRNA? 09/03 13:12
19F：→ otneiv:是想看有没有特异性的miRNA 能代表特定体液 09/03 14:39
20F：→ RickyKckao:或许要做miRNA array.. 09/03 15:10
※ 编辑: otneiv 来自: 203.71.2.84 (09/03 16:20)
21F：→ otneiv:这样的话 应该要请厂商帮忙? (实验是好像没有相关仪器) 09/03 16:23
22F：→ otneiv:而且价格应该不斐 = =a (老板应该会希望有比较便宜的方法) 09/03 16:28
23F：→ RickyKckao:我之前问过TaqMan miRNA array 四个sample要价八万 09/03 16:36
24F：→ RickyKckao:多问几间有在做miRNA array的厂商看看吧! 09/03 16:37
25F：→ otneiv:感谢帮忙!! 我再跟老板讨论看看好了~~ 09/03 16:41
26F：推 HEK293:荣阳也有做Taqman miRNA array，价格差不多就是了Orz 09/03 17:22
27F：→ HEK293:也可以试试mirDIP先做几个db的比较，做起来比较有信心 09/03 17:23
28F：→ HEK293:其实几个db的预测结果出入也不小，尤其是PicTar很特立独行 09/03 17:24
29F：→ windincloud:我想应该是萃取sRNA後跑NGS之类的定序 然後走 09/03 18:12
30F：→ windincloud:deep sequencing 然後再筛出可能的miRNA 09/03 18:15
31F：→ windincloud:通常还会搭你想要看的array去分析patten 09/03 18:16
32F：推 huuban:找已知的用array，有商品化的很好用 09/04 00:12
33F：→ huuban:找未知，解NGS，无论哪种就先学抽RNA，QC过才能往下做 09/04 00:13