作者nk12914 (等待)
站內Biotech
標題[求救] 14kDa的蛋白一直壓不到
時間Sat Aug 25 22:42:59 2012
我要看的蛋白大小約14kDa,但不知道為啥就是一直壓不到 (抗體確定ok)
試了好多方法，也換過membrane材質，就是一直壓不出來 (連一點背景都沒有!完全空白!)
所以想上來請教大家，請大家能給我一些意見!!拜託~
我的transfer buffer配方
25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, 20% methanol
沒有調pH值，配完直接用
semi-dry跟濕式兩種都試過
濕式 400mA或300mA, 一小時
semi-dry 0.8mA/cm2, 一小時或15V, 45分鐘 (這條件是爬文過參考其他板友的建議)
membrane無論是NC還是PVDF也都試過 (兩種用的都是0.22的)
以上條件通通壓不出來 (崩潰 T.T)
我曾試著把sample拿給我同學，請他幫我做WB (抗體也是我給他的)
結果他用濕式400mA, 一小時 竟然可以壓出來!!!!! (徹底崩潰~~)
我跟他只差二抗不同，transfer buffer配方也是一模一樣
後來我還跟他要了一點二抗 (因為想說會不會是我的二抗壞了)
其他條件完全照他的，結果還是一樣崩潰!!!!!!!!!
大概壓了不下十次以上了吧~始終找不到optimal的條件
真的不知道是哪裡出了問題
想請問大家，無論是濕式或是semi-dry，我用的條件是OK的嗎?
可是其他人都能壓到<20kDa的，為什麼我都壓不到 T.T
抗體出問題? 可是請我同學幫忙，結果也OK
本身細胞表現量不高? 可是我上q-PCR，Ct值幾乎跟GAPDH一樣
實在想不出來還有什麼地方有問題了
還是要再提高methanol的濃度呢?
可以請有經驗的大家救救我吧~那是我的target protein，一直壓不出來真是生不如死阿~
麻煩大家了 (鞠躬~)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.24.70.217
1F：推 alaric:你確定proteins transfer 到membrane了? 08/26 01:14
2F：→ alaric:懷疑, 您是不是把電接反了? 08/26 01:15
3F：→ alaric:先檢查SDS-PAGE是否跑好, 再檢查是否轉過去membrane? 08/26 01:16
回alaric大，我可以很確定電極沒有接反耶，因為同一片membrane，GAPDH都壓得出來
SDS-PAGE跑的時候看起來也沒什麼異狀，所以應該不是電極接反的問題
4F：推 martyrtitan:SDS-free Meth提高到30%試試 08/26 01:29
謝謝martyrtitan大的建議，我再試試看~
5F：→ im9527tw:幾%的SDS-PAGE? 08/26 01:33
10%跟12%的SDS-PAGE都試過了
6F：推 robinduck:q-pcr是RNA的表現，時間點應該比protein早不少 08/26 02:12
7F：→ robinduck:另外transfer完拿膠去染coomassie blue看有沒有你的band 08/26 02:14
我也有染過coomassie blue了，如果是semi-dry, 55kDa以下的幾乎都不在gel上了
這樣的話應該也代表我的蛋白也跟著過去membrane了吧?
8F：→ blence:不要再改條件了,直接去同學的實驗室跟著做一遍比較實在 08/26 04:42
9F：推 wadeedaw:也許根本不是轉的問題 這種半乾條件一定都會過去阿 08/26 07:37
恩~理論上來說確實這樣的條件應該都會過去，但我想說是不是已經過頭了~
因為壓出來的片子是清清如水，連一點背景都沒有
※ 編輯: nk12914 來自: 114.24.70.217 (08/26 10:09)
10F：推 martyrtitan:墊兩層就知道啦 08/26 11:52
回m大，其實也試過墊兩層，marker 11kDa確實會跑到第二張mambrane，但還是壓不到蛋白
11F：推 icome:你有染ponceau S確認嗎... 08/26 12:13
有耶，blocking前都會先染，確實在26kDa以下的部分比較染不太到
※ 編輯: nk12914 來自: 114.24.72.212 (08/26 16:00)
12F：→ aeeaee1128:膜改用GE這牌,transfer時間縮半(有過即可,不用全過) 08/27 00:30
13F：→ solomo:底片空白?顯影劑失效?呈色劑失效? 08/28 00:12
14F：推 joseph103331:跟著做一次比較保險 直接用眼睛看比較準 08/28 00:33
15F：→ joseph103331:很多的細部差異用口述很難告知 08/28 00:34
16F：推 spirithorse:淚推...我懂版大的苦!!! 08/28 02:02
17F：→ Anvec:實驗做不出來 有很多很多因素 有時候是不被發覺的地方 08/28 07:38
18F：→ Anvec:比如電源供應器的穩定性 建議你直接去你同學的實驗室做一次 08/28 07:38
19F：→ Anvec:排除是操作問題後 再一個一個試 比如借 buffer 借器材 08/28 07:40
20F：→ Anvec:pH 值有時候也會影響 如果 pH meter 不準的話 08/28 07:41
21F：→ formosana:我之前也有壓過14KD的,不要跑太久速度要調慢,不然會跳海 08/31 14:53
22F：→ formosana:不建議用Semi-dry 常常都轉不過去 08/31 14:55
23F：→ formosana:濕式我有時候會讓他overnight或4小時以上喔!!! 08/31 14:58
24F：→ nk12914:那可以請問福爾摩沙大~你的transfer條件是多少? 謝謝~ 08/31 16:57
25F：推 alaric:考慮提高SDS-PAGE濃度至18%, 或是確定CBR後可以看到你要的 09/06 23:48
26F：→ alaric:基本是每條bands 14kD附近, 最好要清晰可分辨. 09/06 23:50
27F：→ anniepyng:semi-dry不適合transfer小分子蛋白，用濕式比較適合 09/09 15:02
28F：推 formosana:400mA 20V 害怕過頭就加兩張membrane 09/12 23:02
29F：→ formosana:之前有別的實驗室都壓不出來,結果是沒有用二次水配 09/12 23:06
30F：推 windyflyer:我也有差不多的痛..可是我連GAPDH都爆炸了 囧 09/26 13:00