作者nk12914 (等待)
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标题[求救] 14kDa的蛋白一直压不到
时间Sat Aug 25 22:42:59 2012
我要看的蛋白大小约14kDa,但不知道为啥就是一直压不到 (抗体确定ok)
试了好多方法，也换过membrane材质，就是一直压不出来 (连一点背景都没有!完全空白!)
所以想上来请教大家，请大家能给我一些意见!!拜托~
我的transfer buffer配方
25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, 20% methanol
没有调pH值，配完直接用
semi-dry跟湿式两种都试过
湿式 400mA或300mA, 一小时
semi-dry 0.8mA/cm2, 一小时或15V, 45分钟 (这条件是爬文过参考其他板友的建议)
membrane无论是NC还是PVDF也都试过 (两种用的都是0.22的)
以上条件通通压不出来 (崩溃 T.T)
我曾试着把sample拿给我同学，请他帮我做WB (抗体也是我给他的)
结果他用湿式400mA, 一小时 竟然可以压出来!!!!! (彻底崩溃~~)
我跟他只差二抗不同，transfer buffer配方也是一模一样
後来我还跟他要了一点二抗 (因为想说会不会是我的二抗坏了)
其他条件完全照他的，结果还是一样崩溃!!!!!!!!!
大概压了不下十次以上了吧~始终找不到optimal的条件
真的不知道是哪里出了问题
想请问大家，无论是湿式或是semi-dry，我用的条件是OK的吗?
可是其他人都能压到<20kDa的，为什麽我都压不到 T.T
抗体出问题? 可是请我同学帮忙，结果也OK
本身细胞表现量不高? 可是我上q-PCR，Ct值几乎跟GAPDH一样
实在想不出来还有什麽地方有问题了
还是要再提高methanol的浓度呢?
可以请有经验的大家救救我吧~那是我的target protein，一直压不出来真是生不如死阿~
麻烦大家了 (鞠躬~)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.24.70.217
1F：推 alaric:你确定proteins transfer 到membrane了? 08/26 01:14
2F：→ alaric:怀疑, 您是不是把电接反了? 08/26 01:15
3F：→ alaric:先检查SDS-PAGE是否跑好, 再检查是否转过去membrane? 08/26 01:16
回alaric大，我可以很确定电极没有接反耶，因为同一片membrane，GAPDH都压得出来
SDS-PAGE跑的时候看起来也没什麽异状，所以应该不是电极接反的问题
4F：推 martyrtitan:SDS-free Meth提高到30%试试 08/26 01:29
谢谢martyrtitan大的建议，我再试试看~
5F：→ im9527tw:几%的SDS-PAGE? 08/26 01:33
10%跟12%的SDS-PAGE都试过了
6F：推 robinduck:q-pcr是RNA的表现，时间点应该比protein早不少 08/26 02:12
7F：→ robinduck:另外transfer完拿胶去染coomassie blue看有没有你的band 08/26 02:14
我也有染过coomassie blue了，如果是semi-dry, 55kDa以下的几乎都不在gel上了
这样的话应该也代表我的蛋白也跟着过去membrane了吧?
8F：→ blence:不要再改条件了,直接去同学的实验室跟着做一遍比较实在 08/26 04:42
9F：推 wadeedaw:也许根本不是转的问题 这种半乾条件一定都会过去阿 08/26 07:37
恩~理论上来说确实这样的条件应该都会过去，但我想说是不是已经过头了~
因为压出来的片子是清清如水，连一点背景都没有
※ 编辑: nk12914 来自: 114.24.70.217 (08/26 10:09)
10F：推 martyrtitan:垫两层就知道啦 08/26 11:52
回m大，其实也试过垫两层，marker 11kDa确实会跑到第二张mambrane，但还是压不到蛋白
11F：推 icome:你有染ponceau S确认吗... 08/26 12:13
有耶，blocking前都会先染，确实在26kDa以下的部分比较染不太到
※ 编辑: nk12914 来自: 114.24.72.212 (08/26 16:00)
12F：→ aeeaee1128:膜改用GE这牌,transfer时间缩半(有过即可,不用全过) 08/27 00:30
13F：→ solomo:底片空白?显影剂失效?呈色剂失效? 08/28 00:12
14F：推 joseph103331:跟着做一次比较保险 直接用眼睛看比较准 08/28 00:33
15F：→ joseph103331:很多的细部差异用口述很难告知 08/28 00:34
16F：推 spirithorse:泪推...我懂版大的苦!!! 08/28 02:02
17F：→ Anvec:实验做不出来 有很多很多因素 有时候是不被发觉的地方 08/28 07:38
18F：→ Anvec:比如电源供应器的稳定性 建议你直接去你同学的实验室做一次 08/28 07:38
19F：→ Anvec:排除是操作问题後 再一个一个试 比如借 buffer 借器材 08/28 07:40
20F：→ Anvec:pH 值有时候也会影响 如果 pH meter 不准的话 08/28 07:41
21F：→ formosana:我之前也有压过14KD的,不要跑太久速度要调慢,不然会跳海 08/31 14:53
22F：→ formosana:不建议用Semi-dry 常常都转不过去 08/31 14:55
23F：→ formosana:湿式我有时候会让他overnight或4小时以上喔!!! 08/31 14:58
24F：→ nk12914:那可以请问福尔摩沙大~你的transfer条件是多少? 谢谢~ 08/31 16:57
25F：推 alaric:考虑提高SDS-PAGE浓度至18%, 或是确定CBR後可以看到你要的 09/06 23:48
26F：→ alaric:基本是每条bands 14kD附近, 最好要清晰可分辨. 09/06 23:50
27F：→ anniepyng:semi-dry不适合transfer小分子蛋白，用湿式比较适合 09/09 15:02
28F：推 formosana:400mA 20V 害怕过头就加两张membrane 09/12 23:02
29F：→ formosana:之前有别的实验室都压不出来,结果是没有用二次水配 09/12 23:06
30F：推 windyflyer:我也有差不多的痛..可是我连GAPDH都爆炸了 囧 09/26 13:00