作者koala11234 (wei)
看板Biotech
標題[求救] Real-time PCR undetermine???
時間Sun Aug 12 15:04:46 2012
各位板友們好 小弟前來請教關於Q-PCR的問題 還請有經驗的高手們不吝指教
使用的是ABI的系統 看的是一般的mRNA不是miRNA
我想看的一個上皮細胞分化基因Involucrin 使用的internal control為GAPDH
研究對象為口腔上皮細胞 OECM-1 FADU SAS此三株細胞 後兩株較為惡性
第一株為較為良性的口腔上皮癌細胞 因此其分化Marker(Involucrin)的表現量
相較另二組癌細胞高 然而奇怪的是 當我同時拿三株細胞cDNA跑Q-PCR時
後面兩株較為惡性的細胞皆能收到Ct值 然而第一株OECM1卻總是undetermine
曾經跑出過一次有接收到ct值的DATA 確是在第4個cycle就收到 且以上的每次實驗
GAPDH均在20cycle上下 我們這邊實驗習慣並沒有再轉cDNA前定量RNA的量
單純收六公分的細胞培養盤約七八分滿後 將RNA用 40ul 回溶後 取3ul轉cDNA
想問板上使否有高手可以給小弟些意見 目前想到的嘗試方案:
1.減低probe的量(推測是此細胞株此分化基因實在太高)
2.增高cDNA的量(毫無思考的嚐試看看)
3.稀釋cDNA去跑跑看(也是認為是此基因表現太高 不過這樣做GAPDH的cycle數
想必也會變到很後面)
還請各位高手给小弟弟提點提點 也祝各位大俠實驗順利
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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◆ From: 120.126.57.76
1F：推 ckr:how about the dissociation curve? 08/12 20:17
2F：推 preprice:1.5ml 08/12 21:58
3F：→ a90648:第四個cycle就有訊號表示量很多，你可以稀釋後再跑跑看 08/12 22:22
4F：→ koala11234:taqman有再看dissociation curve嗎? p大那是什麼意思呢 08/12 22:45
5F：→ RickyKckao:taqman沒得看dissociation curve SYBR green系統才有 08/12 23:53
6F：→ RickyKckao:OECM的分化基因跑完qPCR之後的curve是像一般的S型嗎? 08/12 23:56
7F：→ koala11234:沒耶它就是一直抖抖的 沒有到閾值所以undetermine 08/13 01:17
8F：推 kingtiger:是否跑個膠確認RNA是否有抽到並確定其quality? 08/13 11:56
9F：→ koala11234:GAPDH18個cycle就P出來了 應該品質還可以吧ˊ_>aˋ 08/13 13:41
10F：推 qiet:有variant或mutation？ 08/14 10:00