作者koala11234 (wei)
看板Biotech
标题[求救] Real-time PCR undetermine???
时间Sun Aug 12 15:04:46 2012
各位板友们好 小弟前来请教关於Q-PCR的问题 还请有经验的高手们不吝指教
使用的是ABI的系统 看的是一般的mRNA不是miRNA
我想看的一个上皮细胞分化基因Involucrin 使用的internal control为GAPDH
研究对象为口腔上皮细胞 OECM-1 FADU SAS此三株细胞 後两株较为恶性
第一株为较为良性的口腔上皮癌细胞 因此其分化Marker(Involucrin)的表现量
相较另二组癌细胞高 然而奇怪的是 当我同时拿三株细胞cDNA跑Q-PCR时
後面两株较为恶性的细胞皆能收到Ct值 然而第一株OECM1却总是undetermine
曾经跑出过一次有接收到ct值的DATA 确是在第4个cycle就收到 且以上的每次实验
GAPDH均在20cycle上下 我们这边实验习惯并没有再转cDNA前定量RNA的量
单纯收六公分的细胞培养盘约七八分满後 将RNA用 40ul 回溶後 取3ul转cDNA
想问板上使否有高手可以给小弟些意见 目前想到的尝试方案:
1.减低probe的量(推测是此细胞株此分化基因实在太高)
2.增高cDNA的量(毫无思考的嚐试看看)
3.稀释cDNA去跑跑看(也是认为是此基因表现太高 不过这样做GAPDH的cycle数
想必也会变到很後面)
还请各位高手给小弟弟提点提点 也祝各位大侠实验顺利
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
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◆ From: 120.126.57.76
1F：推 ckr:how about the dissociation curve? 08/12 20:17
2F：推 preprice:1.5ml 08/12 21:58
3F：→ a90648:第四个cycle就有讯号表示量很多，你可以稀释後再跑跑看 08/12 22:22
4F：→ koala11234:taqman有再看dissociation curve吗? p大那是什麽意思呢 08/12 22:45
5F：→ RickyKckao:taqman没得看dissociation curve SYBR green系统才有 08/12 23:53
6F：→ RickyKckao:OECM的分化基因跑完qPCR之後的curve是像一般的S型吗? 08/12 23:56
7F：→ koala11234:没耶它就是一直抖抖的 没有到阈值所以undetermine 08/13 01:17
8F：推 kingtiger:是否跑个胶确认RNA是否有抽到并确定其quality? 08/13 11:56
9F：→ koala11234:GAPDH18个cycle就P出来了 应该品质还可以吧ˊ_>aˋ 08/13 13:41
10F：推 qiet:有variant或mutation？ 08/14 10:00