※ 引述《emilyliu (微笑下的真實)》之銘言： : 各位板友好 幾個有關western的問題想請教 : 1. overnight的話 停在blocking或上一抗overnight (一樣都放在冰箱搖) : 或者200mA transfer 這三種都有看過，請問比較建議停在哪一個步驟？ : 三者對於band會有影響嗎？ Blocking是我自己覺得比較好的停點, 背景髒的話可以block overnight 不然我是放在冰箱靜置而已 上一抗的話怕會太髒 在Transfer的話要看membrane是否會跳海使用 我是不覺得會對band本身有什麼太大影響啦 : 2. 上抗體後(不論一抗二抗)放在冰箱或室溫下搖對實驗會有影響嗎？ : 看過有的實驗室不管一抗二抗一定都放冰箱，有的卻是都放在室溫而已？ 這其實跟經驗與在地調整有關 在哪個實驗室最好就跟著那邊的步驟做做看 做不出來再談調整比較好 畢竟每個實驗室用的reagent多少有些差異 看課本操作是很理想化的方式 但不實際 功課做過後多問比較實際 室溫好處就是抗體結合快速 我們家二抗才半小時XD 另一個溫度的影響就是抗體本身 如果抗體脆弱又想要重複使用 4度並且長時間的一抗反應大概就免不了了 通常會放到4度 overnight都有可能是抗體不行了 或者是東西看不到才會 這麼做 : 3. 我跑的檢體主要是動物組織，常常會有background 很髒，band不夠sharp : 的問題有嘗試增加wash的次數，不過效果似乎有限，之前有聽朋友說過可以 : 延長二抗的時間，(我二抗時間一個小時，他說他是四個小時放冰箱) ，我 : 還沒有試過，想了很久不是很懂為什麼？至於跑出來的band常常會糊糊的不 : 夠sharp，有加過trypsin，但是band常常會跑掉，和原本在該出現的位置會 : 有一點落差，裁membrane常常會裁到有點困擾，效果似乎也還好， : 想請教板友有什麼方法可以改善嗎？ 背景是個很難解的問題 調整抗體濃度與結合溫度是我覺得最有希望的 其他如加強wash時間或加強blocking時間 甚至換掉blocking agent 都是有可能的解 Band很糊就有可能要回頭去檢討是不是電泳的問題 若是懷疑抗體可以用確定的sample進行一次positive的測試 是買的話至少跑出來不要跟抗體附的datasheet上面差得太遠才行 實驗室置備的抗體也不要跟學長姐跑的差太遠才OK : 我知道每間實驗室對於跑western都有自己的protocol，我想請教的是， : 像transfer的時間 (400mA 2~4hr 或200mA overnight) ，上抗時間的 : 長短(Ex: overnight 和兩個小時）對於跑出來band好不好的影響在哪裡？ : 問題有點多，希望有板友能指教 謝謝 重點不在哪樣做比較好 畢竟各實驗室實際情況不同前面有提過 跑的sample也不同 因此很難比較 通常會說反應慢跑出來的東西就漂亮 非專一性結合少 Blocking又完整 Wash也很完整 所以要在低溫操作 連transfer最好也慢慢來 但在某些sample的操作中 這樣的龜毛反而浪費很多時間 而有時候這樣的步驟不夠龜毛又偵測不到蛋白質 因此就需要試....調整western有時真的需要不少功夫 -- --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.249.179.74