※ 引述《emilyliu (微笑下的真实)》之铭言： : 各位板友好 几个有关western的问题想请教 : 1. overnight的话 停在blocking或上一抗overnight (一样都放在冰箱摇) : 或者200mA transfer 这三种都有看过，请问比较建议停在哪一个步骤？ : 三者对於band会有影响吗？ Blocking是我自己觉得比较好的停点, 背景脏的话可以block overnight 不然我是放在冰箱静置而已 上一抗的话怕会太脏 在Transfer的话要看membrane是否会跳海使用 我是不觉得会对band本身有什麽太大影响啦 : 2. 上抗体後(不论一抗二抗)放在冰箱或室温下摇对实验会有影响吗？ : 看过有的实验室不管一抗二抗一定都放冰箱，有的却是都放在室温而已？ 这其实跟经验与在地调整有关 在哪个实验室最好就跟着那边的步骤做做看 做不出来再谈调整比较好 毕竟每个实验室用的reagent多少有些差异 看课本操作是很理想化的方式 但不实际 功课做过後多问比较实际 室温好处就是抗体结合快速 我们家二抗才半小时XD 另一个温度的影响就是抗体本身 如果抗体脆弱又想要重复使用 4度并且长时间的一抗反应大概就免不了了 通常会放到4度 overnight都有可能是抗体不行了 或者是东西看不到才会 这麽做 : 3. 我跑的检体主要是动物组织，常常会有background 很脏，band不够sharp : 的问题有尝试增加wash的次数，不过效果似乎有限，之前有听朋友说过可以 : 延长二抗的时间，(我二抗时间一个小时，他说他是四个小时放冰箱) ，我 : 还没有试过，想了很久不是很懂为什麽？至於跑出来的band常常会糊糊的不 : 够sharp，有加过trypsin，但是band常常会跑掉，和原本在该出现的位置会 : 有一点落差，裁membrane常常会裁到有点困扰，效果似乎也还好， : 想请教板友有什麽方法可以改善吗？ 背景是个很难解的问题 调整抗体浓度与结合温度是我觉得最有希望的 其他如加强wash时间或加强blocking时间 甚至换掉blocking agent 都是有可能的解 Band很糊就有可能要回头去检讨是不是电泳的问题 若是怀疑抗体可以用确定的sample进行一次positive的测试 是买的话至少跑出来不要跟抗体附的datasheet上面差得太远才行 实验室置备的抗体也不要跟学长姐跑的差太远才OK : 我知道每间实验室对於跑western都有自己的protocol，我想请教的是， : 像transfer的时间 (400mA 2~4hr 或200mA overnight) ，上抗时间的 : 长短(Ex: overnight 和两个小时）对於跑出来band好不好的影响在哪里？ : 问题有点多，希望有板友能指教 谢谢 重点不在哪样做比较好 毕竟各实验室实际情况不同前面有提过 跑的sample也不同 因此很难比较 通常会说反应慢跑出来的东西就漂亮 非专一性结合少 Blocking又完整 Wash也很完整 所以要在低温操作 连transfer最好也慢慢来 但在某些sample的操作中 这样的龟毛反而浪费很多时间 而有时候这样的步骤不够龟毛又侦测不到蛋白质 因此就需要试....调整western有时真的需要不少功夫 -- --

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