作者spirithorse (咩)
看板Biotech
標題[求救] transfer 糊掉
時間Thu Jun 21 17:38:20 2012
traget protien: 10~15KDa (in 12% sds gel)
transfer condition: 0.22 um PVDF, 400mA 1hr
因為一直都壓不到我的protein, 下圖是將PVDF染Ponceau S後的結果
http://ppt.cc/~mDh
http://ppt.cc/StAV
上片段較大size整個飄移,不知是不是濾紙加的不夠多
or 實驗室有人說是下層膠沒做好或是上層膠的柵欄歪了(我有確定柵欄OK)
下方比較嚴重的是明顯15KDa後什麼都不見了~
麻煩請大家幫我想想問題大概在哪裡,已經test好多次了都是一樣的結果
感謝QQ
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
※ 編輯: spirithorse 來自: 211.76.175.170 (06/21 17:38)
1F：推 qqmango:transfer電流太強了，低分子量的蛋白穿透PVDF跳海了 06/21 18:47
2F：→ spirithorse:謝謝,請問有比較推薦的transfer條件嗎? 06/21 21:14
3F：→ blence:感覺上transfer之前就出問題了,gel跑完上面的一切都ok嗎？ 06/21 22:34
※ 編輯: spirithorse 來自: 114.35.0.61 (06/21 23:07)
4F：→ spirithorse:sorry我transfer後沒染膠,但是過程中看front dye正常 06/21 23:08
5F：→ aeeaee1128:應該是過熱,導致糊掉..是濕式還是半乾式?? 06/21 23:51
6F：推 mesenchymal:但我覺得marker也有點怪, 跑膠也有問題的樣子 06/21 23:53
7F：推 aeeaee1128:若是半乾式400mA,1小時已經跳海,膜下的濾紙應該有MARK 06/21 23:54
8F：→ aeeaee1128:的痕跡...給完整的流程,才能一一解答... 06/21 23:56
9F：→ jabari:這個可以入選殿堂了@_@" 換濕式的轉看看? buffer?? 06/22 00:31
11F：推 crazybrian:SDS-PAGE running buffer check 一下正確否? 06/22 08:59
抱歉我沒講清楚,transfer是用溼式 400mA 1hr
※ 編輯: spirithorse 來自: 211.76.175.170 (06/22 11:23)
12F：→ aeeaee1128:濕式裡頭放冰雹,外頭用冰加水,300mA 1hr 試看看 06/22 23:09
13F：→ aeeaee1128:或條件不變,PVDF膜疊二張,二張都染看看,4OOmA沒放冰 06/22 23:11
14F：→ aeeaee1128:很容易過熱,雖然我是菜鳥研究助理,但western有6年經驗 06/22 23:14
15F：→ blence:樓上的經驗在原po前文的推文都出現過，應該很難重蹈吧 06/23 00:08
16F：→ blence:原po先前文的圖每個lane平整,對照下gel的問題才該先解決 06/23 00:14