作者spirithorse (咩)
看板Biotech
标题[求救] transfer 糊掉
时间Thu Jun 21 17:38:20 2012
traget protien: 10~15KDa (in 12% sds gel)
transfer condition: 0.22 um PVDF, 400mA 1hr
因为一直都压不到我的protein, 下图是将PVDF染Ponceau S後的结果
http://ppt.cc/~mDh
http://ppt.cc/StAV
上片段较大size整个飘移,不知是不是滤纸加的不够多
or 实验室有人说是下层胶没做好或是上层胶的栅栏歪了(我有确定栅栏OK)
下方比较严重的是明显15KDa後什麽都不见了~
麻烦请大家帮我想想问题大概在哪里,已经test好多次了都是一样的结果
感谢QQ
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
※ 编辑: spirithorse 来自: 211.76.175.170 (06/21 17:38)
1F：推 qqmango:transfer电流太强了，低分子量的蛋白穿透PVDF跳海了 06/21 18:47
2F：→ spirithorse:谢谢,请问有比较推荐的transfer条件吗? 06/21 21:14
3F：→ blence:感觉上transfer之前就出问题了,gel跑完上面的一切都ok吗？ 06/21 22:34
※ 编辑: spirithorse 来自: 114.35.0.61 (06/21 23:07)
4F：→ spirithorse:sorry我transfer後没染胶,但是过程中看front dye正常 06/21 23:08
5F：→ aeeaee1128:应该是过热,导致糊掉..是湿式还是半乾式?? 06/21 23:51
6F：推 mesenchymal:但我觉得marker也有点怪, 跑胶也有问题的样子 06/21 23:53
7F：推 aeeaee1128:若是半乾式400mA,1小时已经跳海,膜下的滤纸应该有MARK 06/21 23:54
8F：→ aeeaee1128:的痕迹...给完整的流程,才能一一解答... 06/21 23:56
9F：→ jabari:这个可以入选殿堂了@_@" 换湿式的转看看? buffer?? 06/22 00:31
11F：推 crazybrian:SDS-PAGE running buffer check 一下正确否? 06/22 08:59
抱歉我没讲清楚,transfer是用湿式 400mA 1hr
※ 编辑: spirithorse 来自: 211.76.175.170 (06/22 11:23)
12F：→ aeeaee1128:湿式里头放冰雹,外头用冰加水,300mA 1hr 试看看 06/22 23:09
13F：→ aeeaee1128:或条件不变,PVDF膜叠二张,二张都染看看,4OOmA没放冰 06/22 23:11
14F：→ aeeaee1128:很容易过热,虽然我是菜鸟研究助理,但western有6年经验 06/22 23:14
15F：→ blence:楼上的经验在原po前文的推文都出现过，应该很难重蹈吧 06/23 00:08
16F：→ blence:原po先前文的图每个lane平整,对照下gel的问题才该先解决 06/23 00:14