作者koala11234 (wei)
看板Biotech
標題[求救] 建立EGFR overexpression stable clone
時間Thu Jun 21 15:54:15 2012
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那麼我就開始了 事情是這樣的 我最近想利用口腔癌細胞株 OECM-1
將其利用transfection(lipofectamine)的方式 送入一個EGFR-pcDNA3.1的質體
送入後用G418(500ug/ml)挑單一colony 養大後之後用G418 keep著
篩了幾代後 發現細胞篩出來的細胞株 有total-EGFR protein表現比較多但上升不明顯
但是downstream signal 卻是很強(p-Akt,p-Erk) 都是western看到的結果
此外細胞型態也有改變 長的很像之前單純用parental OECM-1 treat EGF 的樣子
感覺有一點EMT 細胞變得有點皺皺老老的 型態很像是好事 但問題來了...
想請問板上的人有無做EGFR過度表達clone的經驗
為什麼我的total-EGFR都沒有變很強 但是下游訊號卻實有上升
我目前是將他keep在10%FBS RPMI media
接下來想試試看若是keep在 low serum 條件下有沒有辦法讓total-EGFR看起來多一點
想請問強者的經驗 或是各路英雄的指點 讓小弟實驗能繼續下去
謝謝大家
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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◆ From: 120.126.65.111
1F：推 icome:正常 我之前做ErbB-2也是這樣 06/21 17:53
2F：→ koala11234:真假?所以total-EGFR沒有多很多 這樣將來可以acept? 06/21 19:01
3F：→ koala11234:謝謝ｉ大 但是這樣我接下來要怎跟老闆解釋啊？ＸＤ 06/21 19:02
4F：推 icome:你可以去查以前的文獻 應該很多人做過 06/21 20:21
5F：→ icome:我想是因為這類RTK細胞有嚴格turnover機制讓它不會累積太多 06/21 20:22
6F：→ icome:不過因為訊號仍會增強非常多 已經可以達到目的了 06/21 20:24
7F：→ koala11234:好的 謝謝你有建設性的回答 :) 06/21 20:26
8F：推 AlertMan:想請問你有看過磷酸化EGFR的蛋白表現量嗎? 06/22 16:39
9F：→ koala11234:有耶 只是我們家p-EGFR太古老了 有打算買新的跑跑看:) 06/22 17:40
10F：→ koala11234:之前跑都糊糊的 格下有無高見可以交流交流呢X目 06/22 17:41
11F：→ koala11234:後來有發現說可以試試看加MG132 I大覺得可行嗎? 06/24 10:57
12F：推 icome:proteosome inhibitor? 對細胞影響蠻大的 不好吧 06/29 12:20
13F：推 momyourb:要不試試flow看cell surface 的EGFR 07/09 20:58
14F：→ momyourb:signaling的放大方式也是一解 07/09 21:00