作者koala11234 (wei)
看板Biotech
标题[求救] 建立EGFR overexpression stable clone
时间Thu Jun 21 15:54:15 2012
大家好 此版初PO 伤眼不符规定请提醒之 必定马上删除
那麽我就开始了 事情是这样的 我最近想利用口腔癌细胞株 OECM-1
将其利用transfection(lipofectamine)的方式 送入一个EGFR-pcDNA3.1的质体
送入後用G418(500ug/ml)挑单一colony 养大後之後用G418 keep着
筛了几代後 发现细胞筛出来的细胞株 有total-EGFR protein表现比较多但上升不明显
但是downstream signal 却是很强(p-Akt,p-Erk) 都是western看到的结果
此外细胞型态也有改变 长的很像之前单纯用parental OECM-1 treat EGF 的样子
感觉有一点EMT 细胞变得有点皱皱老老的 型态很像是好事 但问题来了...
想请问板上的人有无做EGFR过度表达clone的经验
为什麽我的total-EGFR都没有变很强 但是下游讯号却实有上升
我目前是将他keep在10%FBS RPMI media
接下来想试试看若是keep在 low serum 条件下有没有办法让total-EGFR看起来多一点
想请问强者的经验 或是各路英雄的指点 让小弟实验能继续下去
谢谢大家
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.65.111
1F：推 icome:正常 我之前做ErbB-2也是这样 06/21 17:53
2F：→ koala11234:真假?所以total-EGFR没有多很多 这样将来可以acept? 06/21 19:01
3F：→ koala11234:谢谢ｉ大 但是这样我接下来要怎跟老板解释啊？ＸＤ 06/21 19:02
4F：推 icome:你可以去查以前的文献 应该很多人做过 06/21 20:21
5F：→ icome:我想是因为这类RTK细胞有严格turnover机制让它不会累积太多 06/21 20:22
6F：→ icome:不过因为讯号仍会增强非常多 已经可以达到目的了 06/21 20:24
7F：→ koala11234:好的 谢谢你有建设性的回答 :) 06/21 20:26
8F：推 AlertMan:想请问你有看过磷酸化EGFR的蛋白表现量吗? 06/22 16:39
9F：→ koala11234:有耶 只是我们家p-EGFR太古老了 有打算买新的跑跑看:) 06/22 17:40
10F：→ koala11234:之前跑都糊糊的 格下有无高见可以交流交流呢X目 06/22 17:41
11F：→ koala11234:後来有发现说可以试试看加MG132 I大觉得可行吗? 06/24 10:57
12F：推 icome:proteosome inhibitor? 对细胞影响蛮大的 不好吧 06/29 12:20
13F：推 momyourb:要不试试flow看cell surface 的EGFR 07/09 20:58
14F：→ momyourb:signaling的放大方式也是一解 07/09 21:00