作者tempsperdu (valine)
看板Biotech
標題[求救] RNA pellet的回溶
時間Sat Jun 16 19:11:26 2012
連續三次RNA濃度都過低(0.1 ug/ul以下)，完全無法轉DNA
以下是我的操作步驟，請大家看看是否有問題，謝謝
1.細胞數量：12 well，50000 cells/well，長7天 （之前也是這個細胞數，抽得出來）
2.TRIzol 400 ul/well，傾斜刮細胞，在顯微鏡下確認細胞已被刮除
3.收集至eppendorf，加chloroform 80 ul，混合均勻靜置2分鐘，12000xg離心15分鐘
4.取上清液170 ul，加isopropanol 200 ul，混合均勻靜置10分鐘，12000xg離心10分鐘
5.倒去上清液，看得到pellet，加75% EtOH in DEPC H2O 1 ml，7500 xg離心5分鐘
6.倒去上清液，看得到pellet，倒置於laminar flow烘乾，確認pellet在管底沒漂走
(自從第一次做RNA extraction發現有有機溶劑汙染後，我都烘乾1 h，確保EtOH沒殘留)
7.看得到管底有一圈，pellet本身變透明，加15 ul DEPC H2O，靜置5分鐘
8.緩慢pipet 5下，spin down，靜置5分鐘，取2 ul以Nano Vue測濃度
曾想過是否是pellet太乾無法回溶，雖然之前我也是烘乾1 h，
拿三天前也是濃度太低的RNA做測試（保存在-70度。三天總該回溶了吧？），
結果濃度和三天前差不多T^T
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◆ From: 210.60.122.200
1F：推 shenhsu:一小時太久了吧 囧 可以用tip吸乾放個10-15分就差不多了 06/16 20:19
2F：→ shenhsu:不然也可以稍微加熱一下 應該是乾到溶不掉了... 06/16 20:20
3F：→ ashiniii:應該不太可能乾到溶不掉,有時候忙都放好幾天才回溶 06/16 21:12
4F：→ ashiniii:也是OK的 06/16 21:12
5F：→ Ianthegood:RNA乾太久好像會無法回溶耶 06/17 00:28
6F：推 qqmango:加熱55-60 10min回溶 06/17 01:31
7F：推 huuban:所以之前有成功過囉？做法上有什麼改變？ 06/17 01:46
8F：推 ckr:加熱回溶試試看 06/17 12:32
加熱回溶會不會破壞RNA呢? 因為我連vortex都害怕會讓它斷掉
9F：→ huuban:qqmango:加熱55-60 10min回溶，我也都是這麼溶的:) 06/17 15:28
10F：→ huuban:啊不對，我是用65度 xD 06/17 15:28
11F：推 joseph103331:單純加熱跟vortex應該不會斷掉啦 06/17 15:47
12F：推 ckr:Trizol的protocol就有55-60度回溶步驟啊 尤其乾一小時應該 06/17 22:13
13F：→ ckr:不好溶 有機溶劑對你後續實驗影響大嗎? 06/17 22:14
據說Q-PCR machine會自動終止（雖然我沒經歷過）
14F：→ huuban:不然去借抽氣機？通常都蠻快就可以抽乾了喔~ 06/18 11:11
15F：→ huuban:之前回收量最高可以到多少呢? 06/18 11:14
只要有0.1 ug/ul以上就可以轉cDNA了，最高有0.2 ug/ul左右吧
16F：→ Realthugz:我記得trizol protocol都有叫你不要晾乾到透明了 06/18 12:45
17F：→ WinnieDad:RNA vortex不太會斷，畢竟不像是genomic DNA那種大分子 06/18 23:11
18F：→ puec2:1小時太久 基本上變透明就算是沒救了 DNA RNA都一樣 06/23 03:03
19F：→ puec2:一點點酒精殘留也不會怎樣 06/23 03:03
20F：→ puec2:你可以把EtOH倒掉以後 spin 5sec 再用tip把剩下的EtOH吸掉 06/23 03:04
21F：→ puec2:風乾1分鐘 06/23 03:04
好，我會試試，謝謝大家
※ 編輯: tempsperdu 來自: 60.251.101.158 (06/23 12:49)
22F：推 ko363630:RNA extraction 沒有加熱的步驟? 07/09 22:34